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CRISPR-Cas9 基因编辑在学术和临床广泛应用，但其潜在遗传毒性风险，如大片段插入（LgIns）研究不足。研究人员通过多种实验，分析不同供体及编辑方案下的 LgIns 情况。结果发现 LgIns 普遍存在，且供体磷酸化可降低风险。该研究为安全使用 Cas9 编辑工具提供关键见解。
在基因编辑领域，CRISPR-Cas9 技术就像一把神奇的 “分子剪刀”，能够精准地切割 DNA，为生命科学研究和临床治疗带来了无限可能。它被广泛应用于学术研究、生物技术开发以及临床治疗等多个方面，帮助科学家们探索基因的奥秘，也为攻克一些疑难杂症带来了新希望。然而，这把 “剪刀” 在使用过程中，真的像我们想象的那么安全吗？
随着 CRISPR-Cas9 技术逐渐走进临床应用，人们越来越担心它可能带来的潜在风险。之前的研究已经发现，该技术可能会导致脱靶突变，就像是射箭时没有射中靶心，反而射到了其他地方。除此之外，还有研究表明它会产生一些意想不到的基因变化，比如非随机的大片段和复杂结构变异、单核苷酸变异增加以及杂合性频繁缺失等。但是，这些研究大多是在没有供体模板的情况下进行的。在实际的基因编辑操作中，供体模板起着重要作用，它就像一个 “模板指南”，引导细胞按照我们的期望对基因进行修改。可不同类型的供体序列对 Cas9 介导的基因编辑结果有什么影响？Cas9 诱导的意外大片段插入（LgIns）情况究竟如何？这些问题就像一团迷雾，一直困扰着科研人员。为了拨开这团迷雾，来自阿卜杜拉国王科技大学（King Abdullah University of Science and Technology，KAUST）的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》杂志上，为我们理解 CRISPR-Cas9 技术的潜在风险提供了重要线索。
研究人员主要运用了两种关键技术方法。一是长读长测序技术 IDMseq（Individual Molecule DNA sequencing），它能给原始目标 DNA 加上独特分子标识符（UMIs），就像给每个 DNA 分子贴上了独一无二的 “小标签”，这样就能对 Cas9 编辑后的细胞中数万个等位基因进行分析，检测出频率低至 0.004% 的各种变异类型 。二是牛津纳米孔技术（ONT）测序，通过这种技术对编辑后的基因位点进行测序，获取详细的基因信息。研究中使用的样本是人类胚胎干细胞（hESCs），这些细胞为研究提供了重要的实验材料。
Cas9 编辑不同类型供体模板导致多样突变谱
研究人员精心设计了三种用于同源定向修复（HDR）的供体模板，分别是单链寡脱氧核苷酸（ssODN，130 nt）、线性双链 DNA（dsDNA，180 bp）和环状双链 DNA（dsDNA 作为质粒，3197 bp），目的是在 EPOR 基因的最后一个外显子中引入 chr19:11,378,195 C>T 点突变。他们把这些供体模板和野生型酿脓链球菌（S.p.）Cas9 核糖核蛋白（RNP）用电穿孔的方法导入 H1 hESCs 细胞中。结果发现，环状 dsDNA 与 S.p. Cas9 RNP 共转染会导致大量细胞死亡，所以后续实验使用了细胞毒性较低的 Alt-R? S.p. HiFi Cas9 与环状 dsDNA 模板进行实验。
对编辑后的细胞进行 IDMseq 分析后发现，在 ssODN 和线性 dsDNA 样本中检测到了预期的点突变，频率分别为 10.06% 和 0.72%，而环状 dsDNA 样本中没有检测到。同时，所有编辑样本中的新生单核苷酸变异（SNVs）显著增加，且这些 SNVs 在 C>T（G>A）转换中富集。在结构变异（SVs）分析方面，未添加供体模板（OnlyCut）的样本中，10.94% 的等位基因在 EPOR 靶区域存在大片段 SVs（>30bp） 。有 ssODN 和线性 dsDNA 供体时，大片段 SV 等位基因频率分别为 8.66% 和 9.86%，环状 dsDNA 样本中该频率较低，为 1.37%。而且，不管供体类型如何，大多数 SVs 都是缺失。研究还发现，Cas9 编辑时存在模板会显著降低大片段缺失的频率，但却意外地增加了 LgIns 的频率。
对 Cas9 编辑等位基因的单分子定量分析揭示大片段插入情况
IDMseq 技术让研究人员能够对长度超过 30bp 的 Cas9 诱导 LgIns 进行定量分析。在编辑后的细胞中检测到了许多插入片段，这些插入片段都在 Cas9 切割位点附近（±200bp），大部分紧邻切割位点。在未添加供体模板的样本中，检测到 52 个（0.43%）长度在 32 - 629bp 的 LgIns。当有供体模板存在时，使用 ssODN 和线性 dsDNA 进行 Cas9 编辑的样本中，LgIns 频率分别增加到 0.79% 和 1.61%。
研究人员进一步探究插入 DNA 的来源，发现未添加供体模板样本中，大多数插入 DNA 是独特的，96.15% 能与人类 hg38 参考基因组比对上，但都不与假定的脱靶位点重叠。25% 的插入 DNA 来自 Cas9 切割位点附近区域（±2kb），其余分别来自靶染色体的远端区域（23.08%）或其他染色体（48.08%）。有趣的是，还检测到两个无法与已知核苷酸序列比对上的插入 DNA，这表明在 Cas9 编辑过程中可能通过易错的 DNA 修复机制产生了新的序列。
Cas9 诱导大片段插入的功能分析揭示插入 DNA 的基因组热点来源
通过对插入 DNA 和编辑区域进行多序列比对，发现它们之间没有明显相似性。利用 RepeatMasker 数据库注释发现，未添加供体模板样本中，大量插入 DNA（46.15%，不包括切割位点 ±2kb 区域内的）来自基因组重复区域，这些区域包含散布重复序列和低复杂性 DNA 序列。其中，逆转座子元件（REs），如长末端重复序列（LTRs）、长散在核元件（LINEs）和短散在核元件（SINEs）占重复序列的 86.21% 。所有插入的 LINEs 都是截断的，且大多数是 LINE1 元件（87.5%）。通过卡方检验发现，各种 RE 插入的观察值与预期值接近，说明 RE 插入的普遍性可能是随机的，意味着 DNA 修复机制在基于 DSB 的 Cas9 编辑过程中随机获取了基因组片段。
研究人员还发现，未添加供体模板样本中，38.46% 的插入 DNA（不包括靶位点 ±2kb 区域内的）位于 FANTOM5 转录起始位点（TSS）峰、ENCODE 候选顺式调控元件（cCREs）和 H3K27Ac 峰附近（±1kb） 。而且，76.92% 的插入 DNA 位于基因座中，还检测到一些来自蛋白质编码区域和 TSS 的插入。在多个基因座的编辑实验中都发现了蛋白质编码序列和 TSS 序列的整合，这揭示了基于 DSB 的 Cas9 编辑存在普遍且被忽视的风险。
模板指导的 Cas9 编辑导致全长或串联多聚体双链 DNA 供体整合
以往研究表明，ssODN 供体可实现高效 HDR，本研究也发现 ssODN 能减少 H1 hESCs 中的大片段缺失。但 ssODN 与 Cas9 RNP 共递送会使意外 LgIns 频率增加 1.8 倍，且大多数插入来自宿主基因组。与 ssODN 不同，线性 dsDNA 样本中 69.78% 的 DNA 插入来自供体本身，其中 12.95% 的插入接近全长，6.47% 包含头对尾串联多聚体供体序列。使用环状 dsDNA 作为供体时，LgIns 频率降低，且大部分插入来自宿主基因组。研究还构建了 CircularHITI 供体进行实验，发现存在质粒骨干序列插入和目标截断插入的情况。
供体 DNA 磷酸化可减少意外 SVs 且不影响 HDR 效率
研究中使用的线性 dsDNA 供体是未经 5′磷酸化的 PCR 扩增产物。研究人员用 5′磷酸化的线性 dsDNA（LinearDsDNAphos）进行实验，发现它与普通线性 dsDNA 在安装预期点突变时编辑效率相似，说明 DNA 磷酸化不影响 HDR。但 LinearDsDNAphos能降低 LgIns 频率，且在减少 LgIns 的同时，提高了 LgIns 中供体整合的比例。此外，使用磷酸化供体时，所有类型的意外大片段 SVs 频率都降低了，如大片段缺失频率下降。这表明供体磷酸化是模板指导的 Cas9 编辑中提高安全性的有效方法。
研究结论表明，CRISPR-Cas9 编辑会导致平均等位基因频率为 0.7%（范围 0.1 - 1.61%）的意外 LgIns，这些 LgIns 来源多样，包括逆转座子元件、调控元件和外显子序列等，可能带来多种风险，如影响基因功能、导致癌症发生等。不同供体模板在 Cas9 编辑中各有特点，ssODN 效率高且副产物少，而线性 dsDNA 存在较多意外的全长和双链供体整合情况。供体 DNA 磷酸化可有效减少意外 SVs，同时不影响 HDR 效率，为提高 Cas9 编辑安全性提供了可行策略。
这项研究首次详细分析了 Cas9 编辑诱导的意外 LgIns，揭示了其潜在风险，为安全使用 Cas9 编辑工具提供了重要依据。在未来的基因编辑研究和临床应用中，科研人员和医生需要更加谨慎地评估和监测这些风险，合理选择供体模板和优化编辑方案，确保基因编辑技术能够安全、有效地造福人类。
