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在哺乳动物胚胎发育中，基因组印记至关重要，但关键印记组合及调控网络不明。研究人员构建 Ha - Ha 融合系统，发现 10 个印记区域的单等位基因表达可支持胚胎足月发育。这为解析印记调控网络提供新工具，意义重大。
在神奇的生命孕育过程中，哺乳动物的胚胎发育一直是科学界重点关注的领域。基因组印记作为其中的关键环节，像一个神秘的 “开关”，掌控着胚胎的正常发育。它通过差异甲基化区域（DMRs）调控印记基因的亲本特异性单等位基因表达，对胚胎和胎儿发育意义非凡。然而，这个 “开关” 的具体调控机制却迷雾重重，哪些印记基因组合是胚胎发育所必需的，一直是困扰科学家们的难题。这不仅阻碍了我们对生命起源和发育的深入理解，也限制了相关医学领域的发展。为了揭开这层神秘面纱，来自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所等单位的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在《Cell Discovery》杂志上。
研究人员为了深入探究印记基因在胚胎发育中的作用，开展了一系列极具创新性的研究。他们构建了一种名为 Ha - Ha 融合（Ha - Ha-fusion）的系统，通过融合携带不同 DMRs 缺失的孤雄单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs）和孤雌单倍体胚胎干细胞（PG-haESCs），得到了携带不同 DMRs 缺失组合的二倍体胚胎干细胞（ESCs），再利用四倍体（4N）胚胎互补实验来评估这些细胞支持胚胎发育的潜力。
在实验过程中，研究人员首先建立了 RFP 标记的 AG-haESCs 和 GFP 标记的 PG-haESCs，并在 2i 培养条件下使其呈现低甲基化状态。经过融合和筛选，获得了具有特定印记状态的二倍体融合 ESCs。研究发现，当删除 10 个印记区域，包括父源的 H19-DMR 和 IG-DMR，以及母源的 Xist-DMR、Igf2r-DMR 等，重建的胚胎能够高效完成足月发育。例如，当在 PG-haESCs 中逐步删除关键的母源 DMRs 时，胚胎的发育潜力逐渐提升，从最初只能发育到 E9.5，到最终能存活至出生后 23 天。
进一步研究表明，DMRs 的非亲本特异性遗传模式也能支持胚胎发育。比如，改变 Snrpn-DMR 的缺失位置，无论是父源还是母源的缺失，都能使胚胎正常发育，这意味着印记基因的关键作用在于调控基因剂量，而非亲本来源。此外，研究人员还发现，通过特定的 DMRs 缺失组合，如在 AG-haESCs 中删除 IG-DMR，在卵母细胞中删除 H19-DMR，半克隆（SC）胚胎能够发育成正常成年小鼠，且印记基因表达模式发生改变。
研究人员主要运用了以下关键技术：一是 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，用于在单倍体干细胞中删除特定的 DMRs；二是全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）技术，来分析细胞的甲基化状态；三是四倍体胚胎互补技术，评估融合干细胞支持胚胎发育的能力；四是细胞融合技术，获得携带不同 DMRs 组合的二倍体 ESCs。
研究结果如下：
- Ha - Ha 融合系统的建立：成功建立基于低甲基化 haESCs 的 Ha - Ha 融合系统，经长期 2i 培养后，haESCs 和二倍体融合 ESCs 呈现印记缺失状态。
- 胚胎发育潜力提升：通过逐步删除母源 DMRs，重建胚胎的发育潜力从 E9.5 提升至 E15.5，部分胚胎甚至能发育至足月。
- 父源 Snrpn-DMR 缺失的作用：父源 Snrpn-DMR 缺失可使融合细胞支持胚胎足月发育，且与母源 Snrpn-DMR 缺失效果相当，表明剂量调控是印记基因的关键。
- 母源 H19-DMR 缺失的影响：母源 H19-DMR 缺失的 SC 胚胎能正常发育至成年，且印记基因表达模式改变，进一步支持了 DMRs 功能的非亲本特异性。
研究结论和讨论部分指出，该研究证实了 10 个印记区域对胚胎足月发育的重要性，明确了单等位基因表达对胚胎和胎儿发育的必要性。同时，研究还发现 DMRs 的功能主要是调控印记基因的表达剂量，而非依赖亲本来源，这一发现支持了 “冲突假说”。然而，研究也存在一定局限性，如重建胚胎发育潜力受限、无法分析印记在胎盘发育中的作用、CRISPR-Cas9 编辑可能存在副作用等。尽管如此，Ha - Ha 融合系统为同时操纵母源和父源印记提供了有力平台，为深入探索胚胎发育过程中的印记调控网络奠定了坚实基础，有望推动生命科学和健康医学领域的进一步发展。
