重磅！靶向 MET 和 RON 受体的人源化双靶点抗体偶联药物：攻克癌症表型异质性的前沿策略

为解决癌症表型异质性带来的治疗难题，浙江大学医学院附属第一医院的研究人员开展针对 MET 和 RON 双靶点抗体 - 药物偶联物（ADC）的研究。结果显示 PCMdt - MMAE 疗效显著，这为癌症治疗提供新策略，值得科研读者深入研读。

　　

浙江大学医学院附属第一医院（State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, National Clinical Research Center for Infectious diseases, First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine）的研究人员 Minghai Wang、Qi Ma 等人在《Acta Pharmacologica Sinica》期刊上发表了题为 “Humanized dual-targeting antibody–drug conjugates specific to MET and RON receptors as a pharmaceutical strategy for the treatment of cancers exhibiting phenotypic heterogeneity” 的论文。这篇论文在癌症治疗领域意义重大，为攻克具有表型异质性的癌症带来了新的思路与方法，有望改善癌症患者的治疗现状，提高患者生存率和生活质量。

研究背景

癌症异质性（Cancer heterogeneity）是指肿瘤内部存在多种具有不同分子和细胞表型的细胞群体。这种异质性源于癌细胞间的基因差异，会导致不同的基因表达模式、增殖潜能和生存能力 。其中，受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）的异常表达是癌症异质性的一个重要表现，例如人表皮生长因子受体 1 和 2（HER1 和 HER2）的异常。癌症异质性给肿瘤治疗带来了巨大挑战，因此开发更有效的创新策略和疗法迫在眉睫。

抗体 - 药物偶联物（antibody–drug conjugate，ADC）作为一种生物治疗药物，近年来在肿瘤靶向治疗中备受关注。它由单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）、连接子和有效载荷三部分组成，能将化疗药物靶向输送到实体肿瘤。像曲妥珠单抗艾坦新（Trastuzumab emtansine，T-DM1）这类 ADC 药物已用于治疗癌症异质性，但它仅对 HER2 高表达的乳腺癌有效 。近年来，一些低效能、高药物抗体比（drug-to-antibody ratio，DAR）的 ADC，如曲妥珠单抗德鲁昔康（trastuzumab deruxtecan，DS-8201a）被批准用于治疗具有表型异质性的癌症。

间充质 - 上皮转化（Mesenchymal-epithelial transition，MET）和原癌基因受体（recepteur d’origine nantais，RON）属于 RTKs 的一个独特亚家族，它们结构和功能相似。在细胞水平上，MET 和 RON 的异常表达会激活一系列生物学过程，促进癌细胞的侵袭性生长、远处转移和化疗耐药 。从病理角度看，它们的异常表达会导致癌细胞出现异质性，在多种癌症如结肠癌、乳腺癌和胰腺癌中都有体现。此外，MET 和 RON 之间存在强烈的信号串扰，这不仅增强了癌细胞的致瘤表型，还可能成为癌细胞逃避靶向治疗的信号补偿途径 。因此，MET 和 RON 成为了导致癌症异质性的重要表型标记。

目前，针对 MET 和 / 或 RON 的临床干预研究备受关注。小分子激酶抑制剂如卡博替尼（cabozantinib）和克唑替尼（crizotinib）已获批用于肿瘤治疗，多种针对 MET 或 RON 的治疗性单克隆抗体也已开发出来，还有一些针对 MET 和 / 或 RON 的 ADC 正在研究中 。不过，肿瘤获得性耐药和靶点表达异质性使得单靶点 ADC 疗法面临巨大挑战，解决这些问题对推进基于 ADC 的癌症治疗至关重要。正是在这样的背景下，研究人员开展了此项研究，旨在开发并验证一种针对 MET 和 RON 的双靶点 ADC，为治疗具有表型异质性的癌症提供新策略。

研究方法

1. 原发性肿瘤样本和免疫组织化学染色：研究人员从浙江大学医学院附属第一医院病理科获取了 244 例胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）和 236 例三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的原发性样本。使用兔抗 MET IgG 抗体和小鼠抗 RON 单克隆抗体 PCM - 7F11 对样本进行 MET 和 RON 的免疫组织化学（immunohistochemical，IHC）染色，并采用先前描述的半定量方法确定其表达水平。
2. 细胞系和试剂：选用了多种癌细胞系，包括乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌等细胞系，以及一些正常细胞系作为对照。使用了多种针对 MET 和 RON 的单克隆抗体、多克隆抗体以及相关试剂，用于后续实验。
3. 双特异性单克隆抗体 PCMbs - MR 的制备和表征：从 PCM Targetech LLC 公司获取双特异性单克隆抗体 PCMbs - MR。以抗 MET 的 PCM - MET01 和抗 RON 的 PCM5B14 为起始材料，通过 “knobs - into - holes” 和免疫球蛋白结构域交叉技术，将它们的互补决定区序列嫁接到人 IgG1/κ 受体框架中，制备出 PCMbs - MR。通过免疫荧光（immunofluorescence，IF）、酶联免疫吸附测定（enzyme - linked immunosorbent assay，ELISA）和蛋白质免疫印迹（Western blot）分析来确定其特异性和敏感性。
4. 基于 PCMbs - MR 的双靶点 ADC 的制备：将单甲基奥瑞他汀 E（monomethyl auristatin E，MMAE）与 PCMbs - MR 偶联，制备出药物抗体比为 4:1 的双靶点 ADC（PCMdt - MMAE）；同时，将 PCMbs - MR 与美登素衍生物 1（DM1）偶联形成 PCMdt - DM1，将 PCM - MET01 与 MMAE 偶联产生 PCM - MET01 - MMAE，以抗 RON 的 ADC（Zt/g4 - MMAE）和常规人 IgG 与 MMAE 偶联产生的 RhIgG - MMAE 作为对照。通过疏水相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）计算平均药物抗体比。
5. MET 和 RON 表达分析：通过流式细胞术分析细胞表面 RON 和 MET 的强度，使用免疫荧光定量试剂盒（QIFIKIT）定量测量细胞表面 RON 和 MET 的总量。
6. PCMbs - MR 诱导的 MET 和 RON 内化实验：基于先前描述的方法，以 4°C 下用 PCM - MET01 和 PCM5B14 混合物处理的对照细胞的 IF 强度为 100%，在 37°C 下用 5μg/mL 的 PCMbs - MR 处理实验组细胞不同时间，通过流式细胞术分析免疫荧光，计算使细胞表面 MET 和 RON 减少 50% 所需的时间（内化效率，）。
7. 细胞周期、细胞活力和细胞死亡检测：采用先前描述的方法，用碘化丙啶标记细胞后通过 Accuri 流式细胞仪分析细胞周期变化；用 MTS 法检测 PCMdt - MMAE 处理 96 小时后的细胞活力；通过台盼蓝排斥试验确定死亡细胞数量。所有实验均重复三次以验证其可重复性和准确性。
8. 药代动力学和毒性研究：使用雌性 Balb/c 小鼠（有或无 BxPC - 3 细胞介导的异种移植肿瘤），通过尾静脉注射单剂量的 PCMdt - MMAE（3 或 10mg/kg 体重），用 MMAE ADC ELISA 试剂盒测定血浆中与 PCMbs - MR 偶联的 MMAE 含量，使用 Phoenix WinNonlinTM 软件包计算药代动力学（pharmacokinetic，PK）参数，通过单剂量尾静脉注射不同剂量（10、30 和 60mg/kg）的 PCMdt - MMAE 确定其最大耐受剂量。在雄性 Sprague - Dawley 大鼠中，通过单剂量注射 10 或 30mg/kg 的 PCMdt - MMAE 研究其急性毒性，监测注射后的临床体征、血液样本和组织样本的变化。
9. 小鼠异种移植肿瘤模型和 PCMdt - MMAE 治疗：所有动物实验均经机构动物护理委员会批准。将不同癌细胞系（如 HCC1806、HT29 等）皮下注射到 6 周龄雌性无胸腺裸鼠体内，当肿瘤体积达到约 150时开始治疗。使用不同的癌细胞系进行疗效比较、剂量依赖性研究和作用持续时间研究，以 RhIgG - MMAE 处理的小鼠作为对照，测量肿瘤体积，实验结束时收集肿瘤并进行称重和组织学分析。
10. 统计分析：使用 GraphPad Prism 6 软件进行统计分析，结果以平均值 ± 标准差表示，通过 Student’s t 检验比较对照组和实验组数据，span data-custom-copy-text="\(P0.05\)"认为差异具有统计学意义。

研究结果

1. MET 和 RON 在原发性 PDAC 和 TNBC 样本中的表达：对 PDAC 和 TNBC 样本进行 IHC 染色后发现，MET 和 RON 的表达具有高度异质性，在单个肿瘤块中呈现出不同的染色强度和模式，包括主要在细胞膜、细胞质以及混合染色模式。在 244 例 PDAC 样本中，89.35% 的样本表达 MET，92.21% 的样本表达 RON，且两者存在多种共表达组合；在 236 例 TNBC 样本中，83.90% 的样本表达 MET，78.37% 的样本表达 RON，同样存在多种共表达情况 。这些结果表明 MET 和 RON 的表达异质性是胰腺癌和乳腺癌的致病特征。
2. MET 和 RON 双特异性单克隆抗体及双靶点 ADC 的制备：成功制备出双特异性单克隆抗体 PCMbs - MR，并进一步制备出双靶点 ADC（PCMdt - MMAE）。PCMbs - MR 能特异性地与细胞表面的 MET、RON 以及两者同时结合，且对人源和猴源的 MET 和 RON 具有结合亲和力，对犬源和鼠源的则无结合特异性。PCMbs - MR 能有效诱导细胞表面 MET 和 RON 的内化，其内化效率与抗 MET 和抗 RON 单克隆抗体相当，是理想的靶向药物递送候选物。
3. PCMdt - MMAE 的药代动力学和毒性：对小鼠进行单剂量注射 PCMdt - MMAE 后发现，其药代动力学符合二室模型，在荷瘤和非荷瘤小鼠中的药代动力学参数相似，表明肿瘤生长不影响 PCMdt - MMAE 的药代动力学。确定 PCMdt - MMAE 在小鼠中的最大耐受剂量约为 30mg/kg，在大鼠中的毒性研究显示，30mg/kg 剂量会导致血液学和血液化学指标出现异常，但这些异常是暂时的、可逆的，表明高达 30mg/kg 的 PCMdt - MMAE 可安全使用。
4. PCMdt - MMAE 对癌细胞周期、活力和死亡的影响：用 PCMdt - MMAE 处理 BxPC - 3 细胞后，细胞周期发生显著变化，期和 S 期减少，期增加；对多种表达不同水平 MET 和 RON 的癌细胞系进行处理后发现，PCMdt - MMAE 能剂量依赖性地降低细胞活力，其值在 1.34 - 3.78μg/mL 之间；对部分癌细胞系的研究表明，PCMdt - MMAE 能诱导大量细胞死亡，不同细胞系对其敏感性有所差异。这些结果表明 PCMdt - MMAE 通过影响细胞周期、降低细胞活力和诱导细胞死亡发挥作用。
5. PCMdt - MMAE 对异质性共表达 MET 和 RON 肿瘤的治疗活性：以 PCM - MET01 - MMAE 和 PCM5B14 - MMAE 为参照，用 HT29 结肠癌细胞（）构建的肿瘤模型研究发现，PCMdt - MMAE 能显著抑制肿瘤生长，其疗效与其他两种 ADC 相当；利用和细胞系进行剂量依赖性研究，发现 PCMdt - MMAE 能剂量依赖性地抑制肿瘤生长，1mg/kg 的剂量就能延迟肿瘤生长，更高剂量（7、10 和 15mg/kg）能更显著地抑制肿瘤生长并根除肿瘤；用、和细胞构建的肿瘤模型研究发现，单剂量 10mg/kg 的 PCMdt - MMAE 能有效抑制肿瘤生长，且作用持久，平均肿瘤抑制浓度（tumoristatic concentration，TSC）为 0.29mg/kg 。这表明 PCMdt - MMAE 对异质性共表达 MET 和 RON 的肿瘤具有高效、持久的治疗活性。

研究结论与讨论

本研究表明，MET 和 RON 在原发性 PDAC 和 TNBC 样本中的差异表达及其不同组合是癌症异质性的特征。双靶点 ADC（PCMdt - MMAE）具有良好的药代动力学和毒理学特征，对异质性共表达 MET 和 RON 的肿瘤具有高效的治疗效果。

PCMbs - MR 作为制备 PCMdt - MMAE 的关键抗体，具有独特优势。它是重组 IgG1，能特异性结合 MET 和 RON；可快速诱导 MET 和 RON 内化，有利于 ADC 发挥作用；易于与多种有效载荷偶联，且预期体内稳定性良好；能有效介导药物递送，在多种癌细胞系中表现出色；还能识别猴源的 MET 和 RON，便于在猴模型中研究 PCMdt - MMAE 的药代动力学和毒理学。

PCMdt - MMAE 的药代动力学特征符合二室模型，与其他临床批准的 ADC 相似，肿瘤生长和 MET、RON 的过表达对其药代动力学影响较小，但还需研究人体正常组织中低水平表达的 MET 和 RON 对其药代动力学的影响。毒理学研究表明，PCMdt - MMAE 在治疗剂量下相对安全，不过 30mg/kg 的剂量会对动物产生一定不良影响，未来使用时应考虑低于此剂量。

PCMdt - MMAE 的生物学活性在体外实验中达到了治疗预期。其作用具有靶点依赖性，通过与 MET 和 / 或 RON 结合并诱导内化，递送 MMAE 发挥细胞毒性，不仅能抑制和杀死共表达 MET 和 RON 的癌细胞，还对仅表达其中一种受体的癌细胞有效，且对具有 MET 和 RON 不同组合表达的异质性癌细胞也有作用。

在异种移植模型中，PCMdt - MMAE 对具有 MET 和 RON 异质性表型的肿瘤疗效显著。其疗效与其他单靶点 ADC 相当，且具有剂量依赖性，能抑制多种来源癌细胞形成的肿瘤生长，对不同 MET 和 RON 表达组合的肿瘤都有效，作用持久。

综上所述，PCMdt - MMAE 为治疗具有表型异质性的癌症提供了一种新颖且有潜力的治疗策略，有望在未来癌症治疗中发挥重要作用，不过还需要进一步开展临床研究来验证其疗效和安全性 。