体内碱基编辑延长朊病毒疾病人源化小鼠模型寿命

一种针对PRNP基因的体内碱基编辑方法，使接种了最常见的散发型和遗传型人类致病性朊病毒分离物的小鼠模型寿命延长了52%。

　　

朊病毒病是一种由朊病毒蛋白（PrP）错误折叠引发的致命神经退行性疾病，目前尚无有效治愈方法。然而，最新研究开发出的基于腺相关病毒（AAV）的体内碱基编辑策略，为治疗这一疾病带来了新希望。

David Liu领导的研究团队设计了13个单导向RNA（sgRNA），目标是将PRNP基因中的特定密码子转换为提前终止密码子，从而实现PrP的敲低。通过使用CBE（胞嘧啶碱基编辑器）将C•G转换为T•A，研究人员成功将Arg、Gln或Trp密码子转换为终止密码子。在HEK293T细胞中测试这些sgRNA的编辑效率时，发现针对Trp 57（W57X）、Arg 37（R37X）、Gln 83（Q83X）和Trp 81（W81X）的编辑效率较高，平均编辑效率分别为57%、54%、52%和52%。

在体内实验中，研究人员使用双AAV载体系统递送碱基编辑器和sgRNA，通过系统注射双AAV PHP.eB编码BE3.9max和PRNP R37X安装的sgRNA，实现了37%的平均编辑效率，小鼠大脑中PrP减少了50%，并在接种人类朊病毒分离物的转基因人类PRNP小鼠中延长了52%的寿命。进一步优化碱基编辑系统后，通过降低病毒剂量6.7倍，实现了63%的平均PrP减少，且在人类细胞或小鼠组织中未检测到具有临床意义的非靶向编辑。

为了评估BE-AAV治疗人类朊病毒病的疗效，研究人员在人类化Tg25109小鼠中进行了人类病理朊病毒分离物挑战研究。小鼠在AAV治疗后一周接种人类朊病毒分离物，包括sCJD MM1和E200K两种亚型。结果显示，接受PRNP R37X安装的BE3.9max治疗的小鼠比对照组小鼠寿命显著延长，sCJD MM1接种组延长了59%，E200K接种组延长了44%。

此外，研究人员还对碱基编辑策略进行了优化。为了降低AAV剂量并提高治疗潜力，研究人员测试了三种增强型SpCas9基础的CBEs，发现TadCBEd的编辑效率最高（61%平均编辑）。进一步优化sgRNA，采用flip-and-extend（F+E）支架，将编辑效率提高到76%。在降低剂量的AAV治疗中，TadCBEd显著提高了编辑效率，PrP敲低效果也得到改善。

在非靶向编辑分析方面，使用CIRCLE-seq方法评估了PRNP R37X安装策略在人类基因组中的非靶向编辑，发现两个位点的非靶向编辑频率高于背景水平，但这些编辑的临床意义不大。在小鼠组织中，通过CIRCLE-seq提名了197个候选非靶向位点，并在不同时间点（35天、100天、600天）的小鼠大脑样本中测序了前100个位点，发现非靶向编辑随时间增加，且与AAV剂量和编辑器表达时间相关。

最后，为了减少非靶向组织中的编辑器表达，研究人员测试了不同的启动子，发现神经元特异性hSYN启动子可以增加编辑对神经元的特异性。通过在AAV表达盒中加入miR-183和miR-122靶标位点，进一步减少了非靶向细胞类型中的转录因子表达，同时提高了目标组织中的编辑效率。

本研究展示了通过体内碱基编辑减少PrP水平可以显著延长朊病毒病小鼠模型的寿命，为治疗人类朊病毒病提供了一种潜在的一次性治疗策略。研究中使用的碱基编辑策略在降低AAV剂量的同时提高了编辑效率，减少了非靶向编辑的风险，提高了治疗的安全性和有效性。尽管研究在小鼠模型中取得了显著成果，但将这些发现转化为人类治疗还需要进一步的研究，包括更广泛的生物分布评估、可能的免疫反应以及在疾病晚期的治疗效果等。该研究还强调了非靶向编辑在临床应用中的潜在风险，并提出了通过优化编辑器表达和递送策略来降低这些风险的方法。