清华大学药学院刘刚教授课题组发文报道了一种基于结核分枝杆菌特异性铁离子转运蛋白IrtAB的新型荧光探针

　　

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近期，清华大学药学院刘刚教授课题组在ACS Central Science发表了题为“Insights into IrtAB: Iron Transport Facilitates Ultrasensitive Detection of Mycobacteria in Both Cellular and Clinical Environments”的研究论文（ https://doi.org/10.1021/acscentsci.4c00676.）。

本研究报道了一种基于结核分枝杆菌特异性铁离子转运蛋白IrtAB的新型荧光探针，该探针具备铁离子响应开关功能，实现了迄今为止在细胞水平和临床菌学水平上对结核分枝杆菌最灵敏、超快速的检测。

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研究背景

结核病 (Tuberculosis，TB)是由单一病原体结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的传染病。结核病最常见的是肺结核 (pulmonary TB)，会导致肺组织破坏，出现咳嗽、咳痰、咯血等症状，严重者可发展为呼吸衰竭。若未及时治疗，结核菌可传播至其他器官，导致结核性脑膜炎、骨结核、肾结核等。WHO研究报告显示，2023年全球约有1080万的新发结核病例和125万的死亡病例[1]。自新冠之后 (COVID-19，2020 to 2021)，TB再次成为致死人数最多的单一病原体感染引起的疾病[2]。

菌学诊断是结核病确诊的金标准，其中用于染色结核分枝杆菌细胞壁成分的金胺O法，已沿用超过百年。自2014年WHO在全球推广Xpert MTB/RIF技术以来，结核病的诊断和年度新发病例的减少效率并未显著提升，可能的原因包括：一是该技术检测成本昂贵，在TB高负担国家和地区普及困难，二是，高达约三分之一的新确诊结核病患者已经产生耐药性，该法并不能给出药敏结果，用于精准指导用药。因此，快速、高灵敏度的细菌学检测方法仍然是研究的重点。单细胞荧光诊断技术因其高灵敏度、高特异性、快速检测及较低成本等优势，备受期待。目前虽然报道了一些基于代谢途径和酶开关机制的Mtb荧光探针，但其灵敏度较低 (>100 μM)，响应时间长(>1 h)，且停留在实验室水平，尚无临床转化的成果。

刘刚教授课题组长期致力于新型结核荧光探针的研究，先前报道了多个基于特异性硝基还原酶开关机制的新型Mtb荧光探针（Analytic Chemistry, 2024, 96, 4, 1576-1586；Chem Commun (Camb). 2021, 57, 13174-13177.）及药敏实验方法（ACS Infect. Dis. 2019, 5(6), 949-961），同时实现了良好的标记宿主细胞内结核分枝杆菌能力。这些荧光团包括香豆素探针、花菁荧光探针及罗丹明荧光探针。

本研究则聚焦于结核分枝杆菌细胞膜上的铁载体转运蛋白IrtAB，利用其主动从外环境摄取并转运极微量铁离子的机制，开发出一种超灵敏且快速的新型荧光试剂

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研究内容

研究首先对结核分枝杆菌自身分泌的铁离子转运蛋白IrtAB天然配体mycobactin (MbT)进行了结构修饰，并在分子骨架上分别引入S构型、R构型甲基，合成了不同的MbT类似物（图1），实现了该类多肽化合物的克级制备能力。研究系统考察了红色荧光团，包括花菁系列荧光团 (Cy)和罗丹明系列荧光团 (Rho)，设计并合成了系列MbT-荧光团共缀探针 (MbTCFps，图2)。

图1 MbT类似物的化学合成

图2 MbTCFps的化学结构

研究发现新型探针分子N14G相较于其它荧光分子，表现出最强的菌内荧光强度，且具有极高的灵敏度，在浓度低至1.0  nM条件下，依旧可以对M. smegmatis菌实现19倍的荧光增强作用；在10 nM条件下，只需5分钟的孵育时间，即可实现134倍的荧光增强作用。共聚焦荧光显微镜成像显示，N14G对M. smegmatis标记主要集中在细胞膜上，与IrtAB转运蛋白在结核菌细胞膜上高表达密切相关。延长孵育时间至24小时，N14G依旧具有良好的荧光标记能力，证明N14G在孵育过程中具有优异的化学稳定性和光学稳定性。热致死和抗TB药物处理实验结果显示，细菌在死亡/损伤条件下，对N14G的摄取显著降低，再次验证了MbT转运和细胞结构/膜结构的完整性密切相关（图3）。

图3. MbTCFps的荧光标记能力

研究进一步发现，MbTCFps螯合三价铁离子(Fe³⁺)后可有效淬灭此类分子的荧光，并且合成的N14G-Fe （图4）也能够在N14G-F菌内产生荧光，特异地标记结核分枝杆菌。相关实验发现，N14G-Fe可以被IrtAB蛋白还原并实现荧光信号的开启，不仅验证了引入铁离子开关的可行性，也证明了IrtAB蛋白同时具备转运和还原Fe3?的双重功能（图4）。

图4. “铁开关”荧光探针N14G-Fe的结构和功能验证

分子对接显示，N14G和N14G-Fe和IrtAB蛋白的结合部分(SID)均有较强的相互作用。采用IrtAB的敲除菌和回补菌再一次研究证明，荧光的产生依赖于IrtAB转运蛋白（图5）。

图5. IrtAB蛋白的功能验证

与北京胸科医院孙照刚教授合作研究证明，N14G和N14G-Fe对结核分枝杆菌野生株H37Rv的检测限为34个菌落。对于临床TB患者痰液的诊断，N14G和N14G-Fe也只需0.1 μM的浓度及10 分钟染色时间就能有效标记TB患者痰液中的结核菌，其灵敏度远超现有标准诊断试剂金胺O（图6）。

图6. TB患者痰液的临床诊断

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总结

本研究以结核菌的膜转运蛋白(IrtAB)为靶点，基于铁载体的转运机制和三价铁离子控制的荧光开关机制，开发了新型结核菌荧光探针。这种荧光探针具有超高灵敏度（1-10 nm）和超快响应速度（5-10分钟）的特点，可用于快速检测结核分枝杆菌，尤其在临床上可实现对结核病患者痰液的快速诊断。

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致谢

本研究由在读博士生倪典墨、已毕业博士生洪小巧等共同作为第一作者完成，并得到了首都医科大学北京胸科医院的支持。该研究工作得到了国家自然科学基金的资助（资助号：81773575, 81573289, 81161120402）以及Bill & Melinda Gates Foundation, TB Drug Accelerator phase I and II: Hit generation for tuberculosis drug discovery, Global health grant number OPP1024029。

相关论文链接：

https://doi.org/10.1021/acscentsci.4c00676

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04293

https://doi.org/10.1021/acsinfecdis.9b00006

参考文献：

[1] Organization, W. H. Global Tuberculosis Report 2023, 2024.

[2] Berida, T.; Lindsley, C. W. Move over COVID, tuberculosis is once again the leading cause of death from a single infectious disease. J. Med. Chem. 2024, 67, 21633-21640.

[3] Zheng, P.; Somersan-Karakaya, S.; Lu, S.; Roberts, J.; Pingle, M.; Warrier, T.; Little, D.; Guo, X.; Brickner, S. J.; Nathan, C. F.; et al. Synthetic calanolides with bactericidal activity against replicating and non replicating Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Chem. 2014, 57, 3755-3772.

[4] Mu, R.; Kong, C.; Yu, W.; Wang, H.; Ma, Y.; Li, X.; Wu, J.; Somersan-Karakaya, S.; Li, H.; Sun, Z.; et al. Nitrooxidoreductase Rv2466c-dependent fluorescent probe for Mycobacterium tuberculosis diagnosis and drug susceptibility testing. Acs Infectious Diseases 2019, 5, 949-961.

[5] Negri, A.; Javidnia, P.; Mu, R.; Zhang, X.; Vendome, J.; Gold, B.; Roberts, J.; Barman, D.; Ioerger, T.; Sacchettini, J. C.; et al. Identification of a mycothiol-dependent nitroreductase from Mycobacterium tuberculosis. ACS Infect. Dis. 2018, 4, 771-787.

[6] Li, X.; Geng, P.; Hong, X.; Sun, Z.; Liu, G. Detecting Mycobacterium tuberculosis using a nitrofuranyl calanolide-trehalose probe based on nitroreductase Rv2466c. Chem. Commun. 2021, 57, 13174-13177.

[7] Geng, P.; Hong, X.; Li, X.; Ni, D.; Liu, G. Optimization of nitrofuranyl calanolides for the fluorescent detection of Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Med. Chem. 2022, 244, 114835-114835.

[8] Hong, X.; Geng, P.; Tian, N.; Li, X.; Gao, M.; Nie, L.; Sun, Z.; Liu, G. From bench to clinic: a nitroreductase Rv3368c-responsive cyanine-based probe for the specific detection of live Mycobacterium tuberculosis. Anal. Chem. 2024, 96, 1576-1586.

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.4c00676