突破性研究：使用 PacBio PureTarget panel表征退行性重复扩增障碍

在基因组中，DNA通常被类比为一本记载了多种指导身体中细胞配方的食谱。串联重复（tandem repeats）在这个类比中扮演什么角色呢？它们就像是在汤里加一小撮盐一样的简单操作。加个一次或两次是没问题的，但重复加一千次就可能会破坏整道菜。

在人类基因组中，某些特定的DNA序列会发生串联重复，即这些序列会连续多次出现在基因组的同一位置上。正常情况下，这些重复序列的数量在人群中有一定的变异，但通常保持在一个稳定的范围内。然而，在某些情况下，这些重复序列的数量可能会异常增加，即发生“扩增”。当重复序列的数量超过某个阈值时，它们就可能变得致病。这些扩增位于基因组的“黑暗区域”，传统的测序技术难以准确读取。

这就是PacBio HiFi测序发挥作用的地方。HiFi测序提供了长度和准确性，自信地解决这些具有挑战性的重复区域。这篇文章将探讨最新的突破性研究，利用HiFi长读长的力量来揭示重复扩增，并识别导致退行性疾病的突变。

HiFi测序技术在基因组的“黑暗区域”照进了一束光

HiFi测序将传统短读长测序的准确性与全面变异检测所需的长读长相结合。具有出色的准确性、均匀覆盖度和无GC偏好性等特点，能够检测几乎所有的基因组变异。

HiFi测序因其在全基因组测序中的显著优势而闻名，同时，它也在靶向测序应用方面取得了突破，例如前面提到的“黑暗区域”和串联重复。PacBio已经与前沿研究人员合作开发了预制panel，这些panel靶向基因组的”黑暗区域”和可能对药物安全性和疗效产生影响的基因，分别是 Twist Alliance Dark Genes panel和 Long-read Pharmacogenomics panel。

PacBio 现已升级了其靶向基因panel系列，发布了PureTarget repeat expansion panel，旨在提供神经系统疾病的关键见解。PacBio还开发了一种用于识别和可视化串联重复的工具，称为TRGT和TRVZ，可用于分析全基因组和靶向数据。

PureTarget 长读长测序panel为神经系统疾病的临床研究提供支持

2024 年 3 月，PacBio 宣布推出 PureTarget repeat expansion panel。该panel包含20个临床相关基因，靶向难以测序的串联重复序列——那些以往被认为是“黑暗”的区域，现在由于 HiFi 测序的准确性而变得可以触及。这在理解共济失调、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和脆性 X 综合征等疾病方面取得了重大进展。

PureTarget panel建立在旧版No-amp方法的广泛更新和优化之上。PureTarget采用先进的CRISPR-Cas9富集方法，通过保留天然DNA来确保高准确性，从而保留了必要的表观遗传特征，包括CpG位点的甲基化。与传统PCR方法相比，这种“无PCR”方法减少了错误，并且大小偏差更少，使其成为现代基因组研究中必不可少的工具。该panel还整合了多个目标并实现了混样，因此研究人员可以快速为其感兴趣的目标生成大量数据。

PureTarget推进退行性眼病研究

PureTarget panel在研究与串联重复相关的退行性眼病方面产生了深远的影响。该panel是伦敦大学Alice Davidson博士领导的Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy (FECD)研究的核心内容，并在 2024 年欧洲人类遗传学会会议上进行了介绍。FECD是一种常见的与年龄相关的退行性疾病，会引起角膜肿胀并导致视力模糊或混浊。角膜移植目前被认为是治疗的最佳选择，但考虑到失败率和对供体组织的需求不断增加，迫切需要新的疗法来取代这种“最后手段”。

此前发现，81%的FECD患者在TCF4基因内有三联体重复 (CTG18.1)。与大多数串联重复疾病的情况一样，重复长度超过一定阈值与疾病的表现相对应，并且通常严重程度会不断增加。

PacBio靶向测序的早期研究表明，这种CTG18.1重复在血液中不稳定，但关于这种重复如何影响FECD的机制仍存在疑问。随着最近发布的PacBio PureTarget repeat expansion panel对TCF4的覆盖，伦敦大学的科学家能够简化他们的方法，减少DNA上样，提高混样能力，并加快他们的研究进展。

直方图显示了含有双等位基因扩增的样本的 CTG18.1 重复长度分布。所有测序的等位基因均显示重复长度不稳定性(Hafford-Tear et al., 2019)。

研究人员利用患者匹配的白细胞和培养的角膜内皮细胞（难以大量获得），发现在受影响的眼细胞中独特的存在的CTG18.1重复，从1000到>5500个串联重复不等，并且发现一旦扩增，CTG18.1在患病的角膜内皮中就会高度变化且不稳定。这一发现表明，这些重复序列的不稳定性可能是导致 FECD 症状的原因，为治疗发展提供了新的方向。

作为更难研究的串联重复疾病的模型系统，该研究强调了PureTarget panel如何帮助科学家更深入地研究退行性疾病的遗传原因，为新疗法带来希望。

使用PureTarget解锁ALS和FTD中C9orf72的遗传学

在研究ALS（一种导致肌肉控制逐渐丧失的毁灭性疾病）时，对更全面的重复扩增panel的需求尤为明显。来自Mayo Clinic的Marka van Blitterswijk博士实验室正在利用这项技术开展多个项目。实验室的Evan Udine正在牵头针对C9orf72基因的研究，已知该基因与ALS和额颞叶痴呆 (FTD) 有关。他们的目标是找到一种更有效的方法来表征C9orf72重复，摆脱劳动密集型的Southern blot方法。

该团队最初对No-Amp测序的探索得到了与传统方法相当甚至更好的结果，揭示了重复长度与疾病严重程度之间的重要相关性。对血液和脑样本中的串联重复的初步探索与 Southern blot分析相当，并揭示了较短的C9orf72扩增与较长的生存时间相关。

有趣的是，Southern blot研究表明，在检查同一个体一段时间内的血液样本时，一些样本的重复长度可能保持稳定，而另一些样本的重复长度则不断变化。同样，他们发现，甚至在患病和未患病的家庭成员中，重复长度也存在差异。

得益于PureTarget panel和Kinnex RNA Kit带来的增强的长读长测序数据分辨率，研究人员在一些试点研究中观察到了读取覆盖率和长度的改善。该实验室正在开展多个项目，利用这项技术捕获血液和多个脑区中的C9orf72重复扩张，这将揭示相关的临床和病理关联。

他们持续采用PureTarget panel,有望进一步推进与ALS和FTD相关的C9orf72重复扩增的研究。

使用PureTarget和CRISPR基因编辑解决ALS

随着ALS研究的进展，治疗干预的希望越来越大。加州大学旧金山分校Claire Clelland博士的实验室在使用CRISPR-Cas9编辑ALS/FTD致病突变方面处于领先地位。之前的一项研究表明，即使对C9orf72进行10%的编辑也可以使动物模型中的病理减少50%以上。

使用PacBio对C9orf72进行靶向测序的初步研究表明，HiFi测序比其他方法（包括Southern blots和基因特异性和重复引物PCR）更准确、更灵敏。HiFi测序还可以通过将母系和父系遗传的基因拷贝分离为单倍型来实现重复扩增准确定相。

HiFi 测序可以检测混合和未编辑的iPSC克隆。A) 等位基因可以通过WT等位基因上的定相（红色箭头）SNP来区分，但不能通过与参考基因组不同但由两个等位基因共享的纯合 SNP（蓝色和绿色箭头）来区分。B) 在三个独立实验中，对两个细胞系（重复次数约200次和约1400次）的重复扩增进行双 gRNA 切除表明，通过克隆的单分子测序检测到的编辑结果可以高频率检测到保留的重复扩增(RE) 和混合克隆 (Salomonsson & Maltos et al., 2024)。

准确的定相对于基因编辑研究至关重要，因为这可以让您通过克隆的纯度来确定编辑结果。Sanger测序可能会产生不明确的分子特征，如果不进行定相，就无法区分不纯的克隆和具有不同等位基因的单个克隆。

随着PureTarget panel的使用，Clelland实验室已将其研究范围扩大到可视化C9细胞系中的重复嵌合体，其中不同的细胞表现出不同的重复扩增属性。该小组还一直在使用PureTarget panel评估甲基化，这是一种了解基因编辑有效性和安全性的新兴途径。

PureTarget panel在这项研究中取得的持续成功表明，未来人们不仅可以了解ALS等退行性疾病，还可以精准治疗。

利用PureTarget和HiFi测序开启分子诊断的新可能性

PacBio PureTarget panel的开创性工作为退行性重复扩增障碍的研究打开了新的大门。通过对基因组中众所周知的困难区域进行全面的基因分型，该工具正在帮助研究人员发现退行性疾病的遗传原因，并最终为新疗法带来希望。

基因有限公司作为PacBio公司的中国区合作伙伴，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

如果您对该技术感兴趣，请联系我们的工作人员吧~

往期链接：PacBio推出PureTarget™ Repeat Expansion Panel，扩展神经系统疾病端到端临床研究解决方案

参考文献

1.Dolzhenko, E., et al. (2024). Characterization and visualization of tandem repeats at genome scale. Nature Biotechnology, 1-9.

2.Tsai, Y. C., et al. (2022). Identification of a CCG-enriched expanded allele in patients with myotonic dystrophy type 1 using amplification-free long-read sequencing. The Journal of Molecular Diagnostics, 24(11), 1143-1154.

3.Wieben, E. D., et al. (2012). A common trinucleotide repeat expansion within the transcription factor 4 (TCF4, E2-2) gene predicts Fuchs corneal dystrophy. PLoS One, 7(11), e49083.

4.Fautsch, M. P., et al. (2021). TCF4-mediated Fuchs endothelial corneal dystrophy: Insights into a common trinucleotide repeat-associated disease. Progress in retinal and eye research, 81, 100883.

5.Hafford-Tear, N. J., et al. (2019). CRISPR/Cas9-targeted enrichment and long-read sequencing of the Fuchs endothelial corneal dystrophy–associated TCF4 triplet repeat. Genetics in Medicine, 21(9), 2092-2102.

6.DeJesus-Hernandez, M., et al. (2021). Long-read targeted sequencing uncovers clinicopathological associations for C9orf72-linked diseases. Brain, 144(4), 1082-1088.

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8.Meijboom, K. E., et al. (2022). CRISPR/Cas9-mediated excision of ALS/FTD-causing hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 rescues major disease mechanisms in vivo and in vitro. Nature communications, 13(1), 6286.

9.Salomonsson, S. E., Maltos, A. M., et al. (2024). Validated assays for the quantification of C9orf72 human pathology. Scientific Reports, 14(1), 828.

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