伯托NightSHADE影像系统——植物研究利器（上）

植物成像

在植物细胞及分子生物学研究领域，成像技术的不断创新与进步为科学家们提供了更精确、更高效的工具，以揭示生命科学的奥秘。1989年，德国伯托（Berthold）研发出了第一代低光子影像系统LB980 Luminograph。1993年，在这仪器上完成了第一个动物和植物活体基因表达实验，成为世界上第一个活体动（植）物光学影像系统。2010年，德国伯托研发出世界上第一台功能模块化设计的植物活体影像系统NightSHADE。

NightSHADE evo LB 985N 植物活体成像系统作为一款专为植物研究设计的高灵敏度成像设备，凭借其卓越的性能和广泛的应用，迅速赢得了全球科研人员的青睐。30多年来，许多全球知名的高校和科研机构的科学家们选择了德国伯托的植物活体影像系统，包括剑桥大学、加州大学伯克利分校、杜克大学、华盛顿州立大学、清华大学、北京大学、复旦大学等，在许多高质量的期刊上发表了大量的文献，如Nature, PNAS, Nucleic Acids Research, Development Cell, Molecular Plant, The Plant CellCurrent Biology, EMBO reports, eLife, Metabolic Engineering, Plant Biotechnology Journal, New Phytolo-gist, Plant Physiology等。

高灵敏度与高分辨率

Berthold NightSHADE evo LB 985N配备了超灵敏的冷CCD作为检测器，经过德国伯托公司工程师的长期优化和用户使用反馈，获得极高的系统灵敏度。同时，-100℃的绝对制冷温度保证了超高的信噪比。＞90%的量子效率可以保证高质量的成像效果。对于极弱的信号，可以采用长时间曝光的方式累积信号获得很好的实验结果。

专为植物而生的侧视成像模块

和传统的活体成像系统不同，NightSHADE提供了侧视观察的模块，将相机安装在侧面进行成像。在不影响植物生长(如根的向地生长等)的情况下，观察植物的根、茎等器官内目标基因的表达情况。配合旋转样品平台，可以实现高通量的实验观察，提高实验效率。

荧光成像系统

NightSHADE荧光模块具有特殊的能量控制系统——DIODE光能控制器，激发光能量可以在0~100%调节，保证荧光激发能量的长时间稳定，这对于实验结果的准确性是非常重要的。大孔径的发射光滤光片轮设计理念保证了大成像视野和高灵敏度。滤光片的更换非常方便，灵活性很高。

植物光照模块系统

在植物的生物节律和光周期等研究实验中，通常需要长时间多次捕获样本内部目的基因的表达信号，NightSHADE的光照模块系统提供了植物在暗箱内生长的条件。可调节光照高度、波长及每个波长能量的光照系统，让实验人员在整个实验过程中无需移动植物，不仅简化了实验操作也方便了实验人员，同时也让实验结果更加准确。

丰富的配件

NightSHADE的旋转台可以使用不同样本载具，如培养皿、培养瓶、培养管等，配合侧视成像模块，可以对多个样本进行图像采集。同时，NightSHADE可以配备抗冷凝温控载物台，可以同时放置9个培养皿，并由用户根据自己的实验要求将培养皿的温度控制稳定在一个设定的温度值。载物台也配备除雾风扇，防止冷凝影响实验结果。

应用举例

1 植物生长发育研究

这篇发表在Nature Communications上的文章，揭示了Copine蛋白家族中的BONZAI蛋白在玉米和拟南芥的油菜素内酯信号传导中的关键作用，为优化农作物的农艺性状提供了新的分子靶标。研究人员将BON1和ZmBON1的编码序列插入到携带cLuc的载体中，而将SERK4、SERK1、SERK2、BRI1等蛋白的编码序列插入到携带nLuc的载体中。然后，这些载体被转入农杆菌并用于侵染烟草叶片。如果在叶片中BON蛋白与SERK或BRI1蛋白相互作用，荧光素酶的两部分会重新组装成有活性的荧光素酶，通过添加荧光素并使用NightSHADE成像系统来检测荧光信号。结果显示BON蛋白直接与SERK激酶相互作用，从而确保有效的BRI1-SERK相互作用和磷酸化，如图1所示。该研究推进了对BR信号传导的认识，为优化有价值的农艺性状提供了重要目标，也为从更广泛的角度研究真核生物的类固醇激素信号传导和伴随蛋白开辟了道路。

图1. BON分别与SERK和BRI1相互作用。a 酵母双杂交 (Y2H) 试验评估 BON1 的 A 结构域与 SERK4、SERK1 和 SERK2 的激酶结构域 (KD) 的相互作用。b 在用各自编码构建体转染的拟南芥原生质体中进行 BON1-HA 和 SERK4-FLAG 的 Co-IP 试验。c 分裂荧光素酶互补 (SLC) 试验显示 BON1 和 SERK4 之间的相互作用。PIN1 用作阴性对照。d Y2H 试验显示 ZmBON1 和 ZmSERK4-KD 之间的相互作用。e SLC 测定显示本氏烟叶中 ZmBON1 和 ZmSERK4 之间的相互作用。ZmCDPK7 用作阴性对照。f SLC 测定显示本氏烟叶中 BON1 和 BRI1 之间的相互作用。PIN1 用作阴性对照。g 在拟南芥原生质体中进行 BON1-HA 和 BRI1-GFP 的 Co-IP 测定。分别使用抗 HA 和抗 GFP 抗体检测 BON1-HA 和 BRI1-GFP 蛋白。使用 PIN1-HA 作为阴性对照。

2 植物抗病研究

这篇发表在Nature Communications上的文章，克隆了小麦中的Pm55和Pm5V等位基因，并揭示了它们与抑制基因SuPm55的不同相互作用，为培育具有持久和广谱白粉病抗性的小麦品种提供了分子机制和育种策略。研究人员构建了包含Pm55和SuPm55蛋白CC结构域的荧光素酶互补载体，并将它们注射到烟草叶片中。48小时后，使用NightSHADE检测叶片中的荧光信号。实验结果表明，Pm55a和SuPm55的CC结构域在蛋白水平上发生了相互作用，如图2所示。NightSHADE在这项研究中用于验证Pm55和SuPm55蛋白之间的相互作用，结果表明它们确实在蛋白层面发生了相互作用，这对于理解小麦白粉病抗性的分子机制具有重要意义。

图2. Pm55和SuPm55的CC结构域在蛋白质水平上相互作用。a SuPm55 在一叶至五叶幼苗中的表达水平。b SuPm55在成年植物组织中的表达水平。c SuPm55在 TF5V-1 和 Del5VS-4 叶鞘中的表达水平。d 幼苗和成株阶段 TF5V-1 和 Del5VS-4 中Pm55a的表达水平。e Y2H测定中 Pm55a和SuPm55的CC结构域之间的相互作用。AD，激活结构域；BD，结合结构域。SD/-L-T，缺乏 Leu 和 Trp 的 SD 培养基；SD/-L/-T/-H/-A，缺乏 Leu、Trp、His 和 Ade 的 SD 培养基。列标题中的数字表示表达 AD 和 BD 融合的酵母细胞的稀释系列。通过免疫共沉淀 (coIP) (f)、BiFC (g)和 Luc (h) 测定检测Pm55a和SuPm55的CC结构域之间的相互作用。i 当SuPm55的CC结构域都注射到烟草叶子中时，SuPm55的CC结构域抑制了Pm55a引发的细胞死亡。

3 植物产量调控研究

这篇发表在Nature Communications上的文章，发现并研究了一组E2-E3酶对（SiUBC32和SGD1），它们通过泛素化油菜素内酯受体BRI1来调控谷物作物的种子大小和产量，为提高作物产量提供了新的分子机制和遗传资源。研究人员使用了NightSHADE成像系统来观察和记录由SiUBC32和SGD1之间的相互作用所带来的荧光素酶活性。研究人员将SGD1和SiUBC32的编码序列分别克隆到含有nLuc标签和cLuc标签的表达载体中。将含有nLuc-SGD1和cLuc-SiUBC32的表达载体通过农杆菌介导的转化方法共转化到烟草细胞中。研究人员观测到了SGD1与SiUBC32在体内具有直接的相互作用，这种相互作用可能对调节谷物作物的种子大小和产量具有重要意义。通过这种相互作用，SGD1和SiUBC32可能共同参与了泛素化过程，特别是通过泛素化油菜素内酯受体BRI1来调节植物的生长和发育。

图3. SGD1 在分裂荧光素酶互补试验中与 SiUBC32 相互作用。SiBAS1 用作阴性对照。载体对共转化到烟草叶中。

4 生物节律研究

这篇发表在PNAS上的文章揭示了SOS1蛋白通过稳定GIGANTEA蛋白来调节植物生物钟对盐胁迫的响应，从而维持在不同盐浓度下的生物钟周期稳定性。SOS1在高盐水平或每日波动的盐水平下维持着盐反应的稳态。研究人员通过聚乙二醇介导的转染将CCA1:LUC报告质粒引入拟南芥原生质体。为了对转基因植物进行生物发光分析，将含有报告基因的拟南芥幼苗培养7天，在12小时白光12小时黑暗循环下进行。在幼苗上喷洒D-荧光素后，在23°C的恒定蓝光下，使用NightSHADE每2小时捕获一次生物发光图像。所收集图像的振幅、周期和相对振幅误差采用快速傅立叶变换非线性最小二乘法，使用生物节律分析软件系统进行估算，生物发光轨迹均被标准化为12至144小时采样计划的平均表达水平，如图4所示。结果表明，在盐胁迫条件下，SOS1基因突变的幼苗显示出比野生型更长的生物钟周期。SOS1在维持生物钟对盐胁迫响应的稳定性中起着关键作用，特别是在保护GIGANTEA（GI）蛋白不被降解方面。

图4. 盐诱导的钙释放调节 sos1 中的昼夜节律和 GI 蛋白丰度。（A、B、D 和 E）在恒定蓝光下，在用水（对照，A 和 B 的 n = 7；D 和 E 的 n = 12）、25 mM NaCl（A 和 B 的 n = 4；D 和 E 的 n = 7）、25 mM NaCl 加 1 mM 烟酰胺（n = 8；A 和 B）或 25 mM NaCl 加 50 μM GdCl3（n = 9；D 和 E）处理的 sos1-1 幼苗中监测 CAB2:LUC 的 LUC 报告基因活性节律。（A 和 D）生物发光痕迹。每个生物发光数据集都标准化为 12 至 144 小时采样计划的平均表达水平。(B 和 E) LUC 报告基因活性的周期估计值。（C 和 F）用钙释放抑制剂处理阻断 sos1-1 中盐诱导的 GI 降解。将十日龄的 35S:GI-HA sos1-1 幼苗在有或没有 50 mM 烟酰胺 (C) 或 1 mM GdCl3 (F) 的情况下用水（作为对照）或 50 mM NaCl 孵育，并在 ZT0 处理后在指示的时间点收获。用 α-HA 抗体检测 GI-HA。CBB，考马斯亮蓝染色。

5 乙烯信号与铜稳态研究

这篇发表在New Phytologist上的文章研究了拟南芥中SPL7蛋白的羧基末端跨膜结构域对植物体内铜稳态和乙烯信号传导的调节作用。研究发现SPL7的跨膜结构域使其能够定位于内质网，并与RAN1蛋白相互作用，这对于植物对乙烯的敏感性至关重要。通过遗传和分子分析，文章揭示了SPL7在乙烯诱导的三重反应中的作用，并发现SPL7能够通过其跨膜结构域调节RAN1的丰度。此外，文章还发现SPL7受到乙烯信号通过EIN3的反馈抑制，为理解植物如何协调铜稳态与乙烯信号传导提供了新的视角。研究人员通过使用NightSHADE系统进行的LUC互补成像分析，直观地观察到SPL7与RAN1之间的相互作用，并据此得出了关于它们在乙烯信号传导中作用的重要结论。

图5. SPL7 通过其跨膜结构域 (TMD) 与 RAN1 相互作用。(a) 使用与琼脂糖珠偶联的绿色荧光蛋白 (GFP) 抗体对 35S:SPL7^746–818^-GFP 幼苗进行免疫沉淀质谱分析，鉴定出乙烯信号相关蛋白。(b、c)荧光素酶 (LUC) 互补成像测定，用于验证全长 SPL7 (b) 和 SPL7TMD (c) 与 RAN1 的相互作用。RAN1 和 SPL7/SPL7TMD 分别与 LUC 的 N 端和 C 端部分融合，以生成 RAN1-nLUC 和 cLUC-SPL7/SPL7TMD 构建体。构建体与 cLUC、nLUC 或 EIN3-nLUC 结合，如图所示，在烟草叶表皮细胞中共表达，并在荧光素存在下成像。颜色表示相对发光强度。（d）拟南芥中SPL7-RAN1相互作用的共免疫沉淀分析。从35S:GFP和 35S:SPL7^746-818^-GFP 幼苗中提取的总蛋白与偶联抗 GFP 抗体的琼脂糖珠一起孵育。

6 植物抗逆研究

这篇发表在Plant Biotechnology Journal上的文章揭示了大豆中GmNFYA通过与GmFVE相互作用并竞争GmHDA13，正向调控大豆耐盐性的分子机制，并鉴定了一个可能有助于培育耐盐大豆品种的GmNFYA启动子单倍型。研究人员使用了德国伯托的NightSHADE仪器来进行分裂荧光素酶互补实验的发光检测。具体来说，他们利用这个仪器测量了在烟草叶片中通过农杆菌介导转化的分裂荧光素酶报告基因的活性，以验证GmNFYA与GmFVE以及GmFVE与GmHDA13之间的蛋白质相互作用。结果显示GmNFYA能够减弱GmFVE与GmHDA13之间的相互作用，这表明GmNFYA可能通过干扰这一复合体来调节大豆的耐盐性，如图6所示。

图6. GmNFYA 相互作用蛋白 GmFVE 充当盐反应的负调节剂。(a) 免疫沉淀-质谱 (IP-MS) 显示 GmFVE 是 GmNFYA 的相互作用蛋白。(b) GmNFYA 在酵母双杂交试验中与 GmFVE 相互作用。-LWHA+X-a-Gal 表示 Leu、Trp、His、Ade 和 X-a-Gal 脱落板。–LW 表示 Leu 和 Trp 脱落板。(c) BiFC 分析本氏烟叶中 GmNFYA 和 GmFVE 之间的相互作用。(d) 本氏烟叶中 GmNFYA 和 GmFVE 相互作用的分裂荧光素酶互补试验。(e) 体内 GmNFYA 和 GmFVE 相互作用的免疫共沉淀 (CoIP) 试验。

重点

NightSHADE evo LB 985N 植物活体成像系统以其高灵敏度和多功能性，为植物科学研究提供了一个强大的工具，帮助研究者更好地理解和探索植物的生理和发育过程。通过使用这个系统，研究人员可以进行精确的实验，从而获得更深入的生物学见解。

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