单细胞原位空间转录组技术在植物空间组学研究的突破

本期内容，我们将为大家解析 MERFISH 技术在植物（拟南芥）研究中取得了哪些突破性的进展。

背景介绍

拟南芥作为植物学研究领域的重要模式植物，对其进行的广泛研究已经使我们能够对其组织的整个发育过程有深入了解，然而却缺乏对整个发育过程中的细胞类型和状态的了解。

本期内容，我们将为大家解析MERFISH(Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)技术在植物（拟南芥）研究中取得了哪些突破性的进展。

Travis A. Lee及Tatsuya Nobori研究团队利用MERFISH技术和snRNA seq技术分别绘制了拟南芥发育过程中6个不同器官的单核转录组图谱并对角果的单核转录组和细胞类型进行了基于成像的空间验证；绘制单细胞分辨率的植物-微生物相互作用的时空图谱，对全面了解该模式生物的细胞类型和状态以及各器官的发育和功能提供了更多有参考价值的数据和信息。

MERFISH

MERFISH(Multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)即多重荧光原位杂交技术，突破了传统的smFISH一次检测3-5种基因的局限，通过组合标记、超高分辨率顺序成像，可同时检测多至1000种基因和6种蛋白的表达和空间定位，得出组织全景图片、细胞图片、检测到的所有转录本、显示每个转录本在细胞中的空间分布并对其定量，实现真正意义上的单细胞原位空间转录组研究，是单细胞测序技术不可或缺的验证手段，同时更加擅长检测到低表达丰度的转录本、发现新的细胞亚型、揭示微环境等。MERFISH技术于2015年诞生于美国哈佛大学庄小威院士实验室，在空间转录组研究领域是不可或缺的研究手段。

1 拟南芥种子发育单细胞图谱

在题为《A Single-Nucleus Atlas of Seed-to-Seed Development in Arabidopsis》一文中，Travis A. Lee及Tatsuya Nobori研究团队利用snRNA seq和MERFISH技术绘制了拟南芥生命周期6种不同器官发育的单核转录组图谱。

为了绘制拟南芥发育的全景图谱，作者收集了六个不同的器官，包括休眠和发芽的种子，三个不同发育时间点的幼苗，发育和完全出现的玫瑰花环，茎(顶端，分枝区域和茎基部) ，一系列花组织(未开放的花芽到完全成熟的花)和长角果(未成熟到完全拉长的绿色长角果)。来自10个样本的总共801,276个细胞核用于下游的单细胞核转录组测序并分析了前50个marker基因的个体表达。许多高表达的marker基因参与光合作用，表明这一生物过程对具有高水平光合作用活性的细胞的转录组具有支配性影响(图1)。

图1. 拟南芥发育图集

(A)跨越植物生命周期的10个发育时间点收集的组织  (B)完全集成数据集和(C)严格的 tSNE筛选数据即 (D)全球tSNE数据集中大型中央簇中前50个marker基因的平均表达 (E)每个数据集的细胞核数 (F)每个数据集中每个细胞核检测到的基因的小提琴图

snRNA-seq中鉴定到的进行了细胞分型和细胞注释的clusters 需要通过组织切片成像的方式进行验证。为了空间分析发芽种子的转录组，利用基于测序的空间转录组学平台生成细胞类型和细胞层特异性的转录组数据，降维和聚类分析显示了两组主要的clusters(图2A)。空间映射显示这些clusters广泛对应于子叶(clusters0/5) 、根尖区域(clusters1) 、表皮(clusters2) 、种皮(clusters3)和前脉管系统(clusters4)(图2B-D)。

由于拟南芥角果的动态生长模式，作者选择了基于成像的MERFISH原位空间转录组学方法，其分辨率更高、成像的组织面积更大，同时可以单分子分辨率在组织切片上可视化呈现转录本的表达。作者选择了140个基因的panel其中包含拟南芥角果相关的marker基因(图2F)。预测为胚和合点胚乳的marker基因被成功定位在组织的预期区域(图2G和H)，基于保卫细胞marker基因FAMA的表达鉴定到了拟南芥叶表皮的气孔谱系基细胞，并验证了保卫细胞marker基因AT3G16340(PDR1)(图2I和J)的表达。

作者通过MERFISH技术绘制的高度特异性的基因表达图谱，不仅测定了拟南芥的发育，还突出了在其数据集中研究细胞类型和发育特异性表达模式的能力(图2G和J)。MERFISH空间原位转录组技术不仅验证了单细胞核转录组测序的聚类结果，还同时实现了对拟南芥复杂器官的细胞聚类注释。

图2. 空间转录组学注释角果细胞类型

(A)1.25天发芽种子的空间转录组学数据的降维和聚类分析 (B到 D)将clusters映射到空间坐标，重点是对应于(C)胚苗和(D)种皮的clusters (E)基于snRNA-seq的数据集对应于子叶的空间表达 (F) MERFISH 140个基因的转录本可视化 (G)在(左)角果和(右)全球聚类数据集中预测为胚(AT3G20150)和合点胚乳(AT2G44240)的marker基因的表达 (H)(左)角果内胚胎的 DAPI 染色 (右)胚胎(黄色)和合点(粉红色)预测标记基因的空间定位 (I)已鉴定的保卫细胞marker基因的空间定位 (J角果细胞数据集(左)和全球数据集(右)中显示的两个保卫细胞谱系marker基因的表达

2 病原菌侵染下植物时间分辨单细胞空间基因调控图谱

在题为《Time-resolved single-cell and spatial gene regulatory atlas of plants under pathogen attack》一文中，Salk Institute Travis A. Lee及Tatsuya Nobori研究团队利用基于MERSCOPE平台的MERFISH技术以及单核多组学 (snMultiome；snRNA-seq + snATAC-seq)，通过时间分辨的单细胞转录组和表观基因组分析对感染有毒和无毒细菌病原体(假单胞杆菌)的拟南芥进行了研究，揭示了许多以前未表征的免疫细胞群和潜在的基因调控模块，其中包含与疾病和抗性相关的TF(转录因子)、假定的 CRE (顺式调控元件)和靶基因。此外，snMultiome 和 MERFISH 数据集的整合揭示了转录组和表观基因组的时空组织以及细菌定植信息。构建了一个单细胞分辨率的植物-微生物相互作用的分子水平时空图谱。

本研究产生了由三种细菌病原体感染的拟南芥叶片的时间分辨 snMultiome 图谱: 一种是有毒的(DC3000) ，两种是无毒的(AvrRpt2和 AvrRpm1)(图1A)。病原体采用低剂量，预计只有一部分植物细胞会感染病原体。研究人员选择了四个不同的时间点，这些时间点处于感染的早期阶段，在之前的大量RNA-seq 研究中观察到了动态转录重编程。以浸水9小时后的样本作为对照，所有样本均在当日同一时间收集(即在不同时间接种病原体) ，以尽量减少昼夜节律的影响。基于 RNA-seq 和 ATAC-seq 数据，来自13个处理条件的总共41,994个细胞通过了 QC。

在snRNA-seq和snATACseq数据上独立进行降维和聚类(图1B) ，一些clusters富含特定的感染条件和时间点(图1C) ，并鉴定到了在单个clusters中特异表达的基因(图1D)。

图1. 细菌病原体感染的拟南芥叶片的时间分辨单核多组学

(A)单核多组学的示意图 (B)基于转录组数据来源的UMAP (C)每种感染情况的UMAP图(D)显示个体cluster 顶部marker基因的点图 (E) UMAP图显示每个细胞核中靠近FDH (F)每个cluster的marker基因的GO富集分析(G)ATAC活动分析示意图。对于每个基因，定位在基因体或上游400bp 区域上的ATAC读数以计算得分被聚集 (H)韧皮部标记 SWEET12的ATAC 活性评分(左)和 mRNA表达(右) (I)每个基因的 mRNA表达与ATAC 活性之间的Pearson 相关系数

时间分辨的空间转录组学揭示免疫亚群

为了验证 snMultiome分析中鉴定的细胞群，并在实际组织环境中分析基因调控模块，作者在感染叶片的组织切片上进行MERFISH 成像(图2A)。作者设计了500个基因的panel，包括叶细胞类型marker基因、涉及免疫、激素途径和表观遗传调节等各种途径的基因，以及各种转录因子基因。MERSCOPE平台成像后，500个基因的空间定位被解码，每个样本检测到数百万个转录本(图2B)。作者在文中指出：MERFISH是一种高度多重的单分子成像技术，可以在单细胞分辨率下检测数百或数千种RNA。snMultiome 和 MERFISH 相互验证了彼此的结果，MERFISH 分析忠实地捕获了病原体感染叶组织在时间过程中的空间基因表达以及使研究者能够探索 snMultiome 分析中定义的细胞群体的空间分布。

图2. 病原体感染叶片中的时间分辨空间转录组学

(A)MERFISH实验的示意图(B)在每个样品中由 MERFISH 检测到的所有转录物的二维图(C)(上图)显示DAPI细胞核染色信号的视野(FOV) (中)在同一视野内细胞分割(下图)检测到的细胞中心点 (D)小提琴图显示每个 MERFISH样品中检测到的细胞(左)和每个细胞(右)独特基因的转录本数量 (E)基于MERFISH检测到的500个基因的表达，生成UMAP图 (F)每个样本中Leiden cluster的空间映射，使用与(E)相同的配色方案 (G)在每个样品中由 MERFISH 检测到的 ALD1的空间表达模式  (H)感染后9小时 ALD1，FMO1和BON3的空间表达模式 (I)感染后9小时后ALD1，FMO1和BON3在每个细胞中的表达热图 (J)在snRNA-seq 数据中cluster2和6的sub-clusters中ALD1，FMO1，BON3和 ICS1的表达

图3. ALD1全转录组和表观基因组的空间定位

(A上图)推算的 mRNA 表达(下图)应用 MERFISH 技术验证ALD1的 mRNA表达。(B)(上) 推算的ICS1的mRNA 表达。(下)用smFISH检测 ICS1的mRNA表达。(C) 估算 的ICS1(顶部)和ALD1(底部)的ATAC活性(图1G)。(D)MERFISH 验证HsfB2b 的mRNA表达。(E) MERFISH 标记的500个基因的空间定位((F)在感染后24小时(hpi) ，在 AvrRpt2(左)和 DC3000(右)感染的植物中用 smFISH 检测到的细菌转录物的空间定位。(G)AvrRpt2(蓝色)和DC3000(红色)以24hpi 感染的植物中每个细菌菌落的五个最近邻植物细胞(y 轴)的细菌转录物(x 轴)和平均时间值的散点图

Vizgen MERSCOPE™

2021年，Vizgen率先将整合了MERFISH与超分辨率成像技术的分析系统MERSCOPE™推向市场。基于核心技术MERFISH技术，MERSCOPE™最大成像面积可达1或3cm²，分辨率100nm，定位单细胞中RNA的空间分布以及定量基因表达。实现真正意义上的原位单细胞空间转录组分析，让基因的表达和定位可视化，推动基因组学的研究步入下一代。

基因有限公司于2022年3月正式签约成为美国Vizgen公司MERSCOPE™超分辨显微成像分析系统在中国区的合作伙伴。负责该仪器的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。同时，上海贝晶生物技术有限公司也提供MERFISH技术服务。想要了解关于更多有关MERFISH的技术信息，可添加下方微信。

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