神经分析方案革新：无标记自动化高通量活细胞神经生长动力学评价

体外神经突生长分析是神经科学研究领域非常重要的实验方法，主要用于评估神经元的结构和功能，在神经相关疾病研究、模型建立和药物评价领域应用广泛。现有的评价方案多基于特定的神经细胞荧光标记，抑或由于设备限制，无法开展神经细胞生命周期的全时程监测。

安捷伦 BioTek 近期推出了全新神经细胞分析软件模块，搭载经典的 Cytation&BioSpa8 高通量活细胞成像平台，可轻松帮助研究者获得 Label Free 的神经突生长动力学分析结果。

Cytation 成像平台的
Label Free 技术优势

无标记成像技术提供了一种在活细胞中评估神经生长的最精简操作方案，相较之下，由于必须证明荧光标记物不会干扰研究中的生物过程，用于活细胞分析的荧光模型需要大量的开发和验证投入。相反，无标记方法能够立即适用于各种样本类型，包括那些不适宜进行荧光操作的样本。此外，使用无标记方法也可以很好的避免荧光成像可能造成的细胞毒性和光毒性效应。

安捷伦 Cytation5&7 成像平台具有独特设计的无标记成像硬件模块，能够提供三种不同的无标记成像模式：无标记明场、无标记高对比度明场及无标记相差成像。三种成像模式为不同的样本类型提供高质量的无标记细胞图像。本文中展示了明场及相差模式获得神经细胞的无标记图像，搭载 BioSpa8 智能培养箱，可自动化开展多通量的活细胞无标记图像采集。

图 1：Cytation 成像系统的三种不同的无标记成像模式

主要实验流程

本文采用 iPSCs 诱导的皮质神经元（iCell GlutaNeurons）模型，细胞接种于 96 孔板后，设置总长度为 5 天的 BioSpa8 培养流程，其中前24小时细胞贴壁生长，随后进行第一次 50% 培养基换液及给药，培养至 48 小时完成第二次培养基换液及给药。最后通过 BioSpa8 程序自动完成后续的神经生长调节剂评价检测。实验流图示意图如下：

图 2：无标记自动化高通量活细胞神经生长评价实验流程

无标记神经细胞基础
生长动态评价结果

在药物评价之前，先对神经细胞的基础生长进行准确评估。

在这个实验方案中，初次拍摄采用 3h 拍照间隔，连续采集 120 小时，采用 Gen5 软件识别神经细胞的总长度用于评价神经细胞生长情况。比较有趣的是，结果发现起始拍照点和三小时后的第二个时间点的神经生长有较大的跳跃（图3C,D），为了探究这个现象，前 6 个小时采用更为密集的拍摄间隔(10min)，用于获得精准的神经细胞生长曲线。结果显示，在培养的前三个小时内，iCell GlutaNeurons 表现出快速和持续的生长增加。对培养前 3 小时神经突平均生长长度进行 Gen5 分析，结果显示每个细胞的生长速率为~ 500 µm/天(图 3F)。在早期快速生长期之后，神经元过渡到慢速生长阶段(15 µm/天，图 3D)。

图 3：无标记神经元基础生长分析。A，20x 相差成像及软件识别；B，20X 明场成像及软件识别。C，相差及明场神经突总长度动力学分析数据。D，24 小时 - 120 小时神经突平均长度线性拟合用于分析平均生长速度。E，拍摄间隔 10 分钟，总拍摄长度 6 小时的神经突生长曲线。F，对前 3 小时的神经突平均长度进行线性拟合用于分析神经元生长速率。

无标记神经突分析
用于评价药物作用效果

神经元生长曲线分析结果可用于帮助选择给药时间点，本方案中选择神经细胞种板后的 24-48 小时完成给药，在 96 孔板上评价了 4 种不同的神经生长调节剂的作用效果，包括 Blebbistatin（布比他汀）、6BIO（公藤甲素）、triptolide（雷公藤内酯）和 Staurosporine（星形孢菌素），每种药物设置 3 个浓度梯度。本分析方案中，能够获得每种药物对神经元突起总长度（图 4）、平均突起长度和神经突数量的定量结果（图 5），并且 Gen5 的动力学曲线分析能够获得每种药物的促神经生长时间窗口、高浓度细胞抑制时间窗口、平均治疗后反应时间等参数（图 5）。

图 4：四种不同的神经调节剂对 iCell GlutaNeurons 的生长作用效果的动态评价。评价指标：神经突总长度，成像模式：20X相差。A：Staurosporine（星形孢菌素）B：Blebbistatin（布比他汀）C：6BIO（公藤甲素）D：triptolide（雷公藤内酯）。

图 5：平均神经突长度和单细胞神经突分支数动力学分析结果用于确定每种药物的治疗反应时间。

最后，通过在 Gen5 软件中计算动力学成像过程最后 12 小时的神经分析参数的平均值，可以获得每种药物的剂量 - 反应曲线（图 6），以下结果展示了总神经突长度、平均神经突长度、单细胞神经突分支数三种不同评价指标获得的药物剂量效应曲线。

图 6：无标记神经突生长分析的剂量反应评估。A：总神经突长度；B：平均神经突长度；C：平均神经突计数。

方案优势小结

本方案中，采用 Cytation5&BioSpa8 平台能够为广大神经领域的用户提供自动化便捷的长时程无标记神经生长方案，通过 Gen5 的曲线分析获得丰富的神经生长动力学参数，其中值得推荐的功能包括：

• 神经细胞生长拍摄间隔灵活，支持数秒至数天的间隔时间调整，适合于不同的研究目的，并且支持可变间隔动力学程序设置；

• 神经细胞成像模式多样，一个程序内兼容明场和相差及荧光场成像；

• 无标记样本神经突识别准确，提供多种神经突分析参数；

• 生长动力学参数丰富：平均生长速率、药物促神经生长时间窗口、高浓度细胞抑制时间窗口、平均治疗后反应时间等。

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关于安捷伦细胞分析

安捷伦细胞分析平台包括xCELLigence RTCA实时细胞分析仪、Novocyte系列流式细胞仪、Seahorse能量代谢分析仪以及Synergy系列微孔板检测仪和Cytation 系列（共聚焦）细胞成像多功能微孔板检测仪。安捷伦细胞分析平台聚焦基础科研与细胞与基因治疗产品的开发全流程，作为适配新一代疗法的强大分析工具，提供多方位的细胞效力检测和深度的细胞分析，并致力于研发、生产质控以及临床的全方位检测与分析方案开发。