学院李庆阁教授团队与深圳疾控扈庆华教授团队联合开发高阶多重分子分型新技术，揭秘致泻性大肠杆菌血清型与致病性关联

　　

致泻性大肠杆菌引起的急性腹泻是发展中国家持续存在的公共卫生威胁，严重危及儿童健康。传统上依赖培养的大肠杆菌血清分型方法耗时费力，加上高质量抗血清需要进口获得，导致常规微生物实验室一半以上的致泻性大肠杆菌分离株无法成功进行血清分型，大大影响了对食源性疾病暴发的快速应对，成为包括我国在内的广大发展中国家细菌学鉴定领域的一个卡脖子问题。同时，致泻性大肠杆菌血清型与致病型之间的关联，也是微生物领域一直以来悬而未决的难题。

2024年9月21日，学院李庆阁教授团队与深圳市疾病预防控制中心扈庆华教授团队合作发表于国际期刊Gut Microbes（IF=12.2）的一项研究中，报道了一种同时识别大肠杆菌182种O抗原、53种H抗原靶基因和12种毒力基因的分子分型平台，能够在4小时内鉴定粪便样本中致泻性大肠杆菌的血清型，研究进一步通过五个省份的多中心临床试验揭示了致泻性大肠杆菌血清型与致病型之间的直接关联，并意外发现大肠杆菌血清型特征基因可以作为区分志贺氏菌和肠道侵袭性大肠杆菌（EIEC）的生物标志物。

该研究基于厦门大学团队于2022年发表在PNAS的高阶多重PCR技术“MeltArray”和“荧光-熔点”二维标签策略，所建立的MeltArray EST分子分型平台仅需5个多重PCR反应，即可识别五类致泻性大肠杆菌的12个毒力基因、182种O血清型及53种H血清型，覆盖几乎所有已知大肠杆菌血清型。值得一提的是，MeltArray EST单个PCR反应最多可检测62个靶基因，创下了闭管PCR一步法检测靶基因数量的新纪录。在176株大肠杆菌参考菌株的验证中，MeltArray EST与传统血清学方法的一致率达96%，与全基因组测序方法的一致率达100%，证明了其在培养菌株鉴定中的高准确性。

图1 大肠杆菌分子分型体系建立

大肠杆菌血清型被认为是识别食源性疾病暴发的标志物，但是基于培养的方法获得分离株的O:H血清型需要近一周的时间，不能快速提供暴发疫情调查的病原学证据。如果能找到一种不依赖培养的方法，将极大缩短检测周期，及时应对暴发疫情的调查。研究团队在“荧光-熔点”二维标签策略的基础上创造性提出“荧光-熔点-峰高”三维标签策略 (图2a)，并通过在阴性粪便中梯度掺入肠道出血性大肠杆菌EHEC的两组模拟实验，证明三维标签策略可以直接应用于粪便核酸样本的检测，确定致泻性大肠杆菌毒力基因、O血清型特征基因与H血清型特征基因之间的关联 (图2b)。

图2 “荧光-熔点-峰高”三维标签策略

研究团队通过对深圳市一起食物中毒事件的病例肛拭子样本的回顾性研究，发现所有的7份病例样本均能检出肠道致病性大肠杆菌EPEC的特征毒力基因，且熔解峰峰高Rm值与血清型特征基因Gp10及H11呈现强相关关系，确认暴发菌株致病型为EPEC，血清型为Gp10:H11（图3），数字PCR绝对定量及分离株测序证实了上述结论。从而证明MeltArray EST能够在获得肛拭子样本4小时内对粪便样本中致泻性大肠杆菌成功进行血清型鉴定。

图3 不依赖培养食源性疾病暴发的回顾性研究

为全面评估MeltArray EST大规模应用效果，研究团队在广东、河南、四川、江苏和浙江开展了一项多中心研究。试验共收集了637份来自腹泻患者的大肠杆菌菌株，在544株致泻性大肠杆菌中，鉴定出218种不同的O:H血清型，每种占总数的不到5%，表现出丰富的血清型多样性（图4）。为了分析血清型与致病型之间的关系，研究人员引入了“血清型纯度SP值”的概念，即每个血清型中属于主导致病型的菌株百分比。研究结果显示，O血清型、H血清型和O:H血清型的SP值分别为84.5%、70.5%和97.2%（图5），表明血清型与其对应的致病型型之间存在一一对应关系。为进一步确认MeltArray EST的分析结果，研究团队从EnteroBase数据库下载全球范围内的全基因组序列进行致病型与血清型预测，分析结果与MeltArray EST一致，证明了本研究发现的血清型与致病型之间关联的普适性。此外值得重视的是，研究团队在来自广东省和河南省的菌株中监测到4株EAEC O104:H4，该血清型是2011年导致欧洲一起导致严重疾病溶血性尿毒综合征（HUS）疾病暴发的元凶，造成4000多人感染，其中50人死亡。尽管这4株菌株相比于欧洲菌株缺少编码志贺毒素的stx2基因，但是已有报道EAEC O104:H4可通过基因水平转移获得stx2基因，提示在全国加强该血清型监测的必要性。

图4 中国五个省份致泻性大肠杆菌致病型与血清型地理分布

图5 致泻性大肠杆菌致病型与血清型的关联

有趣的是，MeltArray EST还首次实现了肠道侵袭性大肠杆菌（EIEC）和志贺氏菌（Shigella）的明确区分。研究团队对257株志贺菌和18株肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）进行了血清型分子鉴定，并从EnteroBase数据库下载了775个志贺氏菌分离株和360个EIEC分离株的全基因组序列（前者覆盖了4种志贺氏菌的52种血清型，后者代表了45种大肠杆菌血清型）进行基于特征序列的血清型预测。结果显示，前者的血清型纯度SP值达到100% (275/275)，后者高达99.8% (1133/1135)（图6），证实志贺氏菌和EIEC由完全不同的O:H血清型构成。尽管绝大部分志贺氏菌和EIEC的H抗原（鞭毛蛋白）不表达，但在本研究中几乎所有志贺氏菌和EIEC菌株（98.4%，1387/1410）中都鉴定出了编码H抗原的基因，这解释了为什么可以通过MeltArray EST区分志贺氏菌和EIEC，但不能通过传统的基于抗血清的凝集反应完全区分这两种细菌。

图6 基于O:H血清型区分志贺氏菌与EIEC

MeltArray EST作为一种高效的血清型分子分型工具，填补了致泻性大肠杆菌血清型鉴定的空白，揭示了长期以来无法回答的血清型与致病型之间的关联，其广泛应用无疑将进一步提高致泻性大肠杆菌的鉴定的准确性、效率和时效性。

厦门大学生命科学学院博士杜琛（现工作于深圳疾控）、公共卫生学院副教授廖逸群为共同第一作者，厦门大学生命科学学院李庆阁教授、许晔副教授和深圳疾控扈庆华教授为共同通讯作者。共同作者包括厦门大学博士研究生周淑娟、杨兆辉，硕士研究生丁聪聪、黄佳钰、徐夷妍，深圳疾控石晓路所长、李迎慧主任技师、江敏主任技师、左乐、李民旭，华大基因边圣哲，国家感染性疾病临床医学研究中心李力强博士，以及盐田区疾控肖娜科长。该研究还得到了中国科学院杭州医学研究所谭蔚泓院士、美国新泽西州立大学Karl Drlica教授、厦门大学赵西林教授以及赖心河教授的指导与帮助。该研究得到了国家科技重大专项、国家重点研发计划、内蒙古自治区重大科技项目、福建省高校产学研联合创新项目、厦门市重大科技项目、深圳市可持续发展专项和深圳市“三名工程”的资助。

李庆阁教授团队长期从事荧光PCR尤其是多重荧光技术平台研究，2001年报告一种新的寡核苷酸杂交反应模式（Nucleic Acids Research），发明置换探针和置换引物（中、美、日、澳及欧洲专利授权）；2004年提出置换探针基因分型技术（Nucleic Acids Research）；2006年发明探针编码实时PCR（Clinical Chemistry，中国发明专利授权）；2011提出自淬灭探针的多色探针熔解曲线变异分析技术（Journal of Molecular Diagnostics，中、美专利授权），2013年提出基于连接反应的“荧光—熔点”二维标记技术（Nucleic Acids Research,中、美、欧洲专利授权）。2022年发明熔解阵列技术（PNAS，中、美、日、韩、欧洲专利授权）。

原文链接：https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2401944

（图/文 李庆阁教授团队）