蛋白质生物偶联药物稳定性增强和疗效改进的拓扑效应

课题组以干扰素和白蛋白结合结构域为概念验证基元，通过合理运用谍标签-谍捕手反应对以及分离型肽介导的定点偶联策略，利用大肠杆菌直接生物合成了三种氨基酸组成和序列极为相近而化学拓扑结构截然不同的蛋白质拓扑异构体。

　　

作为一种天然的生物大分子，蛋白质具有巨大的临床潜力，可作为多种疾病的治疗药物，如癌症、免疫性疾病和代谢紊乱。与小分子药物相比，治疗性蛋白质具有易编程、功能多样、高特异性、低毒性和疗效优异等优势。然而，其临床应用常常受到稳定性差和体内半衰期短等问题的影响。因此，通常将治疗性蛋白质与半衰期延长模块进行生物偶联，以扩大其治疗窗口并改善治疗效果。化学拓扑为蛋白质生物偶联药物的设计和改造提供了独特的维度，正逐渐引起研究者们的关注与重视。研究表明，蛋白质生物偶联药物的拓扑改造能够显著提高其热稳定性、体内半衰期以及抑瘤效果。

近期，为了探究拓扑对蛋白质药物性能的微妙影响，北大化学与分子工程学院张文彬教授课题组以干扰素（IFN，模型蛋白质药物）和白蛋白结合结构域（ABD，半衰期延长模块）为概念验证基元，通过合理运用谍标签-谍捕手反应对以及分离型肽介导的定点偶联策略，利用大肠杆菌直接生物合成了三种氨基酸组成和序列极为相近而化学拓扑结构截然不同的蛋白质拓扑异构体。在蝌蚪形IFN-ABD偶联物中，位于氨基酸序列链中的谍标签与N端的谍捕手反应生成异肽键将两者之间的IFN环化以增强稳定性，而ABD则位于C端以延长循环时间；进一步通过分离型内含肽的胞内偶联反应将ABD的C端与谍捕手的N端进行共价偶联则构建了8字形IFN-ABD偶联物，而将其中谍标签的反应位点进行突变使其无法与谍捕手反应生成异肽键，仅能形成折叠结构相同的非共价复合物，即得到大环状IFN-ABD偶联物。这三个构建均包含相同的组成基元，但是由于不同的区域环化策略而具有不同程度的构象限制。正交酶切实验证明了蝌蚪形、大环状以及8字形IFN-ABD偶联物之间的拓扑结构差异。

图1. 三种IFN-ABD偶联物示意图：8字形、蝌蚪形和大环状

研究发现，在非变性条件下，谍标签与谍捕手的非共价复合物与共价复合物具有类似的结构，各类表征实验难以区分大环状和8字形IFN-ABD偶联物的拓扑结构差异，包括CD光谱、尺寸排阻色谱、受体亲和力，甚至半数抑制浓度IC₅₀。只有在涉及谍标签突变体和谍捕手所形成的非共价复合物的解折叠时，两者呈现出显著的性质差异。例如，8字形IFN-ABD偶联物表现出更高的熔融温度和更好的抗聚集能力，这对在长期储存期间保持蛋白质药物的结构完整性和生物活性尤为有益。有趣的是，蝌蚪形IFN-ABD偶联物的热稳定性因为共价谍复合物的存在而稍好于大环状偶联物，同时又因为未被环化的ABD基元的存在略差于8字形偶联物。这些区别在动物实验中越发明显。首先，在体内半衰期实验中，相较于野生型（~5.0h），蝌蚪形偶联物的半衰期延长至~20.4h，大环状和8字形偶联物则分别延长至~25.6h和~25.9h，同时8字形偶联物的曲线下面积（~52.6μg·h·mL^-1）远大于大环状偶联物（35.2μg·h·mL^-1），表明8字形拓扑结构能够改善吸收、分布或者代谢较慢，最终导致蛋白质药物在体内循环中的水平更高，反映出异肽键的存在赋予了蛋白质生物偶联药物额外的循环稳定性。生物分布实验也显示8字形IFN-ABD偶联物相比于另外两种拓扑偶联物在肿瘤处的富集最为明显，在小鼠肿瘤模型中8字形IFN-ABD偶联物也表现出最好的抗肿瘤活性。

图2. 三种IFN-ABD偶联物的拓扑效应探究：热稳定性（熔融温度、抗热聚集能力）以及多种动物实验（体内半衰期、肿瘤部位荧光衰减以及最后时刻与其他脏器的富集情况对比、小鼠抑瘤实验）说明8字形偶联物为三种拓扑异构体中综合表现最优的候选药物

这项研究通过探究一系列拓扑蛋白质异构体的性质和功能，总结出如下经验以更好地发挥拓扑在实际应用中的功能优势：1）物理相互作用和化学交联都会增加拓扑的复杂性并对分子施加构象限制，更多更强的有效键联关系意味着更受限的构象空间和更高的热力学稳定性；2）环化对稳定性的影响依环大小而不同，较小的环预示着更多的构象限制和更高的折叠稳定性；3）共价交联作为高强度的有效键联关系，在引入折叠结构中时，可大幅提升蛋白质的热稳定性以及机械/蛋白酶稳定性。通过超越蛋白质主链线型结构的认知范式，蛋白质拓扑工程可以兼容并整合其他的生物技术和工程化策略，为提升蛋白质药物性能提供了一个额外的维度。

该研究近期在线发表于Adv. Healthcare Mater，北京大学化学与分子工程学院博士后刘雅杰为该论文的第一作者。张文彬为论文通讯作者。该工作得到了科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京分子科学国家研究中心的资助。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adhm.202400466