2024-06-14 Nature Protocols | 中国科大唐姗团队报道丝氨酸/半胱氨酸水解酶底物鉴定实验指南

　　

2024年6月12日，中国科学技术大学生命科学与医学部唐姗教授团队在Nature Protocols期刊发表了题为“Capturing acyl–enzyme intermediates with genetically encoded 2,3-diaminopropionic acid for hydrolase substrate identification”的研究论文。文中以来自人类疱疹病毒1(human herpesvirus 1 )中的UL36肽酶结构域（UL36^USP）为例，分别在细胞裂解液和活细胞中提供了其底物捕获与鉴定的详细方案。该工作为不同场景下鉴定丝氨酸/半胱氨酸水解酶的底物提供了通用的操作指南。

水解酶调控蛋白质的命运、定位和活性，是一类很重要的药物靶点。水解酶底物的鉴定能促进对其在生理和病理条件下的底物特异性和功能的理解。然而，许多蛋白酶的底物谱不完整，且多种孤儿水解酶的活性也尚未得到表征。

最近，唐姗教授开发了一种基于催化机理的水解酶底物捕获策略，专门用于鉴定半胱氨酸或丝氨酸水解酶的底物。该策略的关键特征是通过遗传密码扩展技术位点特异性地引入可被光激活的2,3-二氨基丙酸（pc-Dap，图1a）来替代催化丝氨酸或半胱氨酸。Dap的引入使原本以氧酯或硫酯键连接的瞬时催化中间体被酰胺键的形式稳定。被捕获的底物片段通过蛋白质组学鉴定，并通过免疫印迹分析验证。

图1. Dap介导的水解酶底物鉴定流程

该实验方案主要包括两大部分， Dap介导的水解酶底物捕获及被捕获底物的质谱鉴定及免疫印迹表征。第一部分根据不同的实验设置，应用于细胞裂解液（步骤1）及贴壁（步骤2）或悬浮（步骤3）哺乳动物细胞中。用户可以根据具体的研究对象特性选择合适的实验方案。第二部分根据蛋白质的含量，可选择凝胶内或磁珠上酶切后，再进行质谱分析。

中国科学技术大学生命科学与医学部博士研究生罗娟和硕士研究生余瑶为论文共同第一作者，唐姗教授为论文的通讯作者。硕士研究生王珂、何思哲和王龙杰参与了工作。广西医科大学第一附属医院的梁芳芳副主任医师及英国医学研究理事会-分子生物学实验室的Jason Chin教授参与了工作的设计与指导。清华大学刘磊教授、中国科学技术大学生命科学与医学部郑基深教授为本工作的开展给予了重要帮助。中国科学技术大学生命科学实验中心与中国科学技术大学理化科学仪器中心为工作提供了实验支持。本研究得到了国家重点研发计划、中国科学技术大学统筹推进世界一流大学和一流学科建设专项资金、及合肥综合性国家科学中心大健康研究院前沿交叉科学与生物医学研究所项目资助。

原文链接：https://rdcu.be/dKCCI