PacBio Onso 短读长测序 Q40+ 准确度，超越 “大海捞针”！

十多年来，Q30（对应碱基识别错误率1/1,000）一直是二代测序（NGS）用来衡量测序准确度的标准，尽管存在固有的局限性，但这一标准一直被认为“足够好”。PacBio Onso 短读长测序仪的出现重新定义了这一标准，其碱基错误率仅为 1/10,000 甚至更低（Q40+）。

出色的准确度是通过创新的结合测序 （SBB） 化学实现的。SBB 的高准确度提供了优化的测序化学、无分子疤痕、极低的假阳性率进而提高罕见变异检测的灵敏度。

我们已经展示过Onso系统在液态活检中的表现（点击链接 全新短读长测序平台Onso推开Q40新世界大门！），接下来将通过三个案例，探索 Onso 系统出色的准确度在公共卫生、人类遗传学研究及肿瘤等不同的领域中如何超越“大海捞针”。

案例一

在公共卫生监测中更密切的关注更多的细菌种类

虽然首次成为头条新闻是在 Covid-19 大流行期间，但目前废水监测已成为流行病学和公共卫生监测的常规和不可或缺的手段。这种演变可以部分归功于“无需培养”的测序技术。

PacBio 和 Zymo Research 近期合作进行了一项废水监测研究（在今年的 ASM年会上做过相关介绍）。该研究使用 Zymo公司的 Quick-DNA/RNA Water Kit 处理真实的废水样品，在 PacBio Onso 系统和Illumina NextSeq 2000 系统上分别测序，正面比较了它们在病原检测、抗微生物药物耐药性（AMR）监测和功能分析方面的表现。

两者均采用 Zymo 分析流程，与 NextSeq 2000 系统相比，在 Onso 系统上测序，所有的样本各个分类水平上均产生了更多的分类群（表1）。这意味着，PacBio SBB 比 SBS 检测到更丰富的微生物多样性（图1）。

表1:  使用 PacBio SBB 和 NextSeq SBS 在各个分类水平获得的分类群的数量。

图1：微生物群落分析，属水平的 Shannon's Diversity Index。（紫红色代表Onso SBB，橙色代表 NextSeq SBS）

与 NextSeq 2000系统相比，基于 Onso 系统的 SBB 也检测到更多的抗微生物药物耐药基因（图2）。这种出色的表现很大程度上是由于 Onso 系统具有更高的检测灵敏度。

图2：每个样品中的抗微生物药物耐药类别以相对丰度展示。采用 SBB （21）检测到的抗微生物药物耐药基因比 SBS （7）多（均使用 Zymo 分析流程）。

尽管流行病学与肿瘤学研究大不相同，但众所周知，这两个领域都有着具有挑战性的样本类型和对高灵敏度和特异性的需求，尤其是当人类健康岌岌可危时。Onso 系统证明，更好的检测意味着更好的结果。

SBB的高准确度为研究人员提供了必要的工具，以用于监测和预测疫情、优化公共卫生管理和水处理策略以及为更好的公共卫生政策提出建议。

案例二

更低的重复率（duplication rates）意味着在胚系变异检测时浪费更少的reads

随着测序能力的提升，临床测序已从靶向测序转向全外显子组测序和全基因组测序。这种转变意味着高准确度的测序不仅是可取的，而且是避免可能会影响治疗决策和对疾病的更深入理解的错误临床信息所绝对必要的1。

PacBio 和 Twist Bioscience 之间的一项合作展示了基于 Onso 系统的 SBB 如何在准确性至关重要时再次发挥作用。该研究使用 Twist Enzymatic Fragmentation 2.0 kit 对 NA1287 gDNA（8 个重复）进行片段化。使用 Twist Exome 2.0 panel 捕获感兴趣区域，并使用 Onso 文库转换试剂盒转换现有的 P5/P7 文库。随后，研究人员采用 2 x 100 bp读长在 Onso 系统上进行全外显子组测序，并将其与 SBS 进行比较。

研究结果表明，Onso 系统上的全外显子组测序在 reads 数、产出和准确度方面均超过了系统参数（表2）。

他们还发现，在衡量超过 30x 覆盖率的碱基百分比、覆盖均一性和重复率时，基于 Onso 系统的 SBB 与 SBS 表现相当或更好（图3）。这种影响在医学相关区域更为明显，以 ACMG 81（81 个基因的列表，包含致病性或可能致病的变异）为代表。与 SBS 相比，使用 SBB 的重复率更低，这意味着总体上浪费的 reads 更少。

图3：基于Onso的 Twist Exome 2.0 测序数据代表性 GATK Picard 指标（30x覆盖度的碱基百分比、覆盖均一性和重复率）。将NA12878（8个重复）的捕获产物进行混样，使用 Onso 文库转换试剂盒进行转换，2×100 bp读长，60 x平均测序深度。

总体而言，这些结果凸显了基于 Onso 系统的 SBB 为临床外显子组测序和疾病研究中的变异检测带来的价值。

案例三 

高灵敏度和特异性用于肿瘤研究中的变异检测

液体活检对基础研究和潜在的诊断研究来讲是一种很有前途的非侵入性方法，但由于游离 DNA（cfDNA）的浓度低，基于 NGS 的分析具有挑战性。传统的短读长测序技术一直在努力捕获这些罕见的 DNA 片段，并努力以可靠检测所需的灵敏度和特异性对其进行测序。

PacBio 和 IDT 之间的一项合作展示了 Onso 短读长测序仪如何成功检测急性髓系白血病 （AML） 样本中的低频变异。该研究使用 IDT xGen 高转化率文库制备技术，对 AML cfDNA 标准品和片段化至 150bp (模拟cfDNA的大小) 的 AML gDNA 标准品进行文库制备。后经过 Onso 文库转换试剂盒（Onso library conversion kit）加上 Onso 系统兼容的测序接头。

合作者对这一工作流程进行了测试，包括基于上样量和基于低等位基因频率的灵敏度测试。采用的上样量从 1ng 的 gDNA 到 50ng 的 cfDNA （以模拟在真实患者样本中发现的少量 DNA)。所有文库，即使是 1 ng 的低上样量，都有 >99.9% 的 reads 比对到参考基因组，≥75% 的碱基中靶率，考虑到 panel 较小（约9 kb)，这一表现相当出色。

当在 Onso 系统上测序时，转换后的 xGen 文库具有极高的准确性：96%的碱基达到 Q40+，83% 的碱基达到 Q50+。这种测序准确度水平在其他短读长测序仪（如SBS系统）上前所未闻的。针对gDNA样品 ，即使上样量低至 1 ng，Onso 系统在 250K reads/样品时 ，也能提供 >99.5% 的灵敏度和 ≥99.7% 的特异性，subsampled 表明即使在非常低的深度时（<24K reads/样品）也能保持此种性能表现（图 4）。而 cfDNA 标准品的表现同样令人印象深刻，即使对于低至 0.5% 的变异等位基因频率（VAF），也能实现 100% 的灵敏度和 ≥99.7% 的特异性（图5）。

图4：在一系列测序深度范围内具有高灵敏度和特异性。采用 xGen cfDNA & FFPE Library Prep Kit 制备3个文库，使用 1ng 和 10ng 标准品上样（标准品靶区域内含有 20 个已知变异）。文库进行混样（n=3）后，使用 xGen Custom Hyb Panel（n=2）进行捕获，并在 PacBio Onso 系统上进行 2 x 150 双端测序。每个文库被 subsampled 到不同的深度，使用 VarDict 进行变异 calling。图表表示三次重复的平均值，误差线表示标准偏差。

图5：针对超低频变异的高灵敏度和特异性。采用 xGen cfDNA & FFPE Library Prep Kit 制备 3个 文库，使用 25ng 和 50ng 标准品上样（标准品靶区域内含有 15 个已知变异）。文库进行混样（n=3）后，使用 xGen Custom Hyb Panel（n=2）进行捕获，并在 PacBio Onso 系统上进行 2 x 150 双端测序。每个文库被 subsampled 到 50M reads，使用 VarDict 进行变异 calling。误差线表示标准偏差。

SBB 的准确度和低噪音可在跨10 倍的读取深度范围内实现卓越的灵敏度和特异性。这些结果表明，减少测序深度以实现实验目的的可能性。这与现在采用更高的测序深度进行体细胞变异检测的常态相比，是一个令人耳目一新的变化。

大胆超越“大海捞针”！

如上的研究只是 Onso 系统潜在应用的几个例子，在这些应用中，准确度仍是超越“大海捞针”的关键。这种更高水平的准确度可以增强公共卫生、疾病研究等领域，为您带来更多的可能。

参考文献:

Poplin R, Zook JM, DePristo M. Challenges of Accuracy in Germline Clinical Sequencing Data. 2021;326(3):268–269. doi:10.1001/jama.2021.0407

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