高质量蛋白质组学数据的秘诀：Covaris自动声波聚焦技术

蛋白质组学

蛋白质组学是研究生物体内所有蛋白质的组成、结构、功能以及相互作用的学科领域。在蛋白质组学研究中，研究者使用各种技术手段来分析蛋白质的表达水平、修饰状态和互作网络，以及它们在不同条件下的动态变化。这些信息对于理解细胞信号传导、代谢调控、疾病机制等方面具有重要意义。

在蛋白质谱的应用过程中，样本制备是非常关键的一环，关系到最终的数据结果。其中，蛋白的提取又是重中之重。如何充分地从组织细胞中释放蛋白？如何在样本处理中尽量保持蛋白质的修饰状态（比如磷酸化等）？为了解决这一问题，Covaris公司提出完整解决方案，基于其非接触式的聚焦超声方式、恒定低温的处理过程，可以充分释放样本中的生物大分子，提高得率，从而进一步提高下游质谱鉴定到的蛋白种类和数量，助力蛋白组学研究。

Covaris自动声波聚焦技术(Adaptive Focused Acoustics®, AFA®)提供了一种自动化、标准化、高通量的质谱分析前样本制备方案。无论是细胞、新鲜组织还是FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织样本，基于AFA技术处理样本不仅可以节约时间，还可以提高富集的多肽/蛋白质的得率和种类，这使得具有低起始量特点的临床样本或者其他类型的样本用于蛋白质组学分析成为可能。

Covaris CryoPrep™

此外，AFA技术搭配CryoPrep™，在生物大分子提取前先粉碎样本，可有效保证组内样本的均质性，保障蛋白质组学和多组学巨大数据量之间的关联性和一致性。该设备利用可控的机械打击力快速地击碎封闭样品袋中冰冻的组织样品。粉粹过程仅需20毫秒，且无交叉污染，无雾性损耗。

应用案例

01

2024年6月21日发表在 nature chemical biology上的文章“Orpinolide disrupts a leukemic dependency on cholesterol transport by inhibiting OSBP”使用了Covaris公司的S2高性能超声样本处理系统进行蛋白质谱的样本制备。该文章通过正交化学确定了Orpinolide，一种合成的内酯类似物，具有显著的抗白血病特性。通过蛋白质组和转录组分析以及基因组的 CRISPR-Cas9筛选，发现Orpinolide通过在内质网-高尔基体膜界面处活跃的磷脂酰肌醇-4-磷酸信号传导的机制破坏高尔基体内平衡。热蛋白质组分析和遗传验证研究表明，氧甾醇结合蛋白OSBP是Orpinolide的直接且具有表型相关性的靶标。

在这篇文章中作者使用Covaris S2高性能超声样本处理系统对4000万KBM7细胞进行蛋白提取，以及通过串联质量标签(TMT)等压标记方法定量超过7800种蛋白。Covaris的非接触式聚焦超声，依靠其高频低能、恒温处理的特点，可以对样本进行较好的破碎，在充分释放生物大分子的同时，防止其降解，在有限的细胞数量中获得更多种类的蛋白质。

图1. W7处理破坏高尔基体蛋白质的稳定性，抑制胆固醇的生物合成。a、与DMSO处理相比，用W7（1μM）处理KBM7细胞8小时后蛋白质组范围的变化。b、将a中蓝色部分不稳定表达蛋白质进行细胞组分和生物学过程(GO)富集分析。c、与 DMSO 处理相比，用 W7(485nM)处理 KBM7细胞6小时后基因表达的变化。d、MSigDB 的两个 WikiPathway 基因组的基因集富集分析(GSEA)显著富集了 W7对 DMSO 的差异基因表达谱。

02

2022年6月02日发表在 Nature Medicine上的文章“Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease” 研究团队提出了一种整合的肝-血浆蛋白质组学方法，用以推断分子病理生理学，并通过液相色谱-质谱联用系统在近600例受试者（包括459例酒精性肝病相关病例和137例健康受试者）的血浆中鉴定蛋白质组学的生物标志物。作者使用基于质谱 （MS） 的蛋白质组学工作流程分析了所有血浆样本和 79 份肝活检样本，总共定量了 5,515 种蛋白质。肝脏蛋白质组中的差异丰度分析揭示了在纤维化阶段、炎症、脂肪变性阶段分别有658种、135种、68种蛋白质显著失调，总共717种独特差异蛋白质。

在此篇文章中，由于肝脏组织中含有大量脂肪和胆汁酸，这些物质会干扰蛋白质的提取过程，导致提取效率低下。此外，肝脏组织中富含胶原蛋白，其存在会增加样品的复杂性和提取的难度。因此，文中作者将肝脏样品在Covaris cryoPREP干粉机中冷冻粉碎，极大的提高了提取效率。然后使用Covaris自动聚焦超声处理系统（Covaris）进行第二轮超声处理，在保护生物大分子样本的同时充分释放蛋白信息。Covaris CryoPrep加上Covaris AFA技术，可以最大限度提高的蛋白得率和保证蛋白质生物信息的完整性（活性），恒温处理，减少热传递，减少局部加热导致的蛋白降解。

图2. 蛋白质组学工作流程。a-c、肝活检样本的蛋白质组分析工作流程。d-f、血浆样品的蛋白质组分析工作流程。g、 用于处理和分析蛋白质组学数据的计算和生物信息学工具。

图3. 肝脏病变对肝脏和血浆蛋白质组的影响。a，肝组织中的蛋白质在纤维化、炎症活性和脂肪变性的不同阶段差异显著。b，肝脏蛋白质组中所有失调蛋白质的分级聚类。c，上调和下调肝脏特异性和分泌蛋白的部分(%)。d，分别与 Kleiner、 NAS 炎症和 NAS 脂肪变性评分相关的前20种蛋白。e，与每个组织学评分相关的前四个蛋白的 log2强度值的分布。

Covaris样本制备系统针对多种样本的蛋白质谱分析开发了一站式解决方案，无论是FFPE样本、激光显微切割样本、还是细胞样本，都能帮助用户高效、稳定地获得生物大分子样本，进而协助用户提升下游实验的数据质量！Covaris公司一直致力于研发基于声学、机械及分子生物学的高性能组织样本处理系统，旨在帮助研究者实现快速、稳定、高效的样品预处理。

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