Western Blot——蛋白电泳

Western Blot

电泳篇

蛋白质印迹技术（免疫印迹实验）又称为Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。Western Blot主要用于检测或分析蛋白，应用领域集中在基因表达研究、抗体活性检测和疾病诊断等。

今天小编为大家介绍Western Blot——蛋白电泳。

电泳原理

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸，通常采用垂直电泳进行分离。

聚丙烯酰胺凝胶的特点

• 聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝胶，具有分子筛作用，其筛孔的大小可人为控制和调节，并且制备重复性好。 

• 聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳结构，没有或很少带有极性基因，因而吸附少，电荷作用小，不易和样品相互作用，化学性质比较稳定。

• 凝胶无色透明，适宜用光密度扫描记录结果，且上样量较少。

• 用途广泛，具有弹性，便于操作，易于保存。

由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的支持物，用于酶带的分离以及进行分子量的测定。

SDS-PAGE电泳各成分对电泳的影响

丙烯酰胺（Aery）单体及N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）的含量及比例决定了凝胶孔径的大小，影响电泳速度和分离效果。凝胶聚合过程中，Acry单体之间形成延伸的多聚链，并通过Bis的作用，连接和交叉成网状结构，最终成为肉眼可见的凝胶。

催化剂过硫酸钠（APS）和加速剂四甲基乙二胺（TEMED）直接影响凝胶聚合质量。二者加量过多，会使Acry单体聚合链较短，聚合不充分，胶的脆性增加；反之，如加量过少，则聚合速度大大降低，甚至只出现所配置的胶溶液黏度稍增加、无胶状物出现的现象。

Tris缓冲液的pH值对于电泳效果起到至关重要的作用。在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCl缓冲系统，浓缩胶是pH 6.7，分离胶pH 8.9；而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离少，在电场作用小，泳动效率低；而氯离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于两者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据分子大小进行分离。

如何提高垂直电泳的分辨率？

保证聚丙烯酰胺充分聚合，可提高凝胶的分辨率。配置凝胶在室温凝固后，可在室温放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。

根据待测蛋白的分子量大小，配置合适浓度的凝胶，可参考下图。

使用长胶电泳效果更好，使较大分子量的蛋白质能实现更好地分离。

常见问题和解决方案

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