单细胞空间转录组技术在阿尔茨海默病研究中取得了什么进展？

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病，是老年人中痴呆的最常见原因，其病理特征主要包括β-淀粉样蛋白（Aβ）形成的淀粉样斑块和过度磷酸化Tau蛋白形成的神经纤维缠结。神经病理学和影像学研究表明，蛋白质聚集体呈渐进性和稳定性积累，但到目前为止，驱动AD进展和受疾病影响的脆弱细胞群的潜在分子和细胞机制仍然知之甚少。因此，本研究利用单细胞和空间基因组学工具（MERFISH多重抗错荧光原位杂交技术）以及来自脑科学计划之细胞图谱网络项目（BICCN）的知识，了解疾病进展对颞中回（MTG）细胞类型的影响。该研究“Integrated multimodal cell atlas of Alzheimer’s disease”于2023年5月艾伦脑科学研究所Mariano I. Gabitto研究团队发表在Research Square预印本上。

本研究使用基于图像的定量神经病理学方法，将涵盖阿尔茨海默病不同疾病阶段的84名供者进行连续的疾病假进展分析和多组学技术分析，对每个供者的单个细胞核进行表征，将其转录组、表观基因组和空间信息以前所未有的分辨率映射到一个共同的细胞类型参考系中。细胞类型比例的时间分析表明，早期生长抑素表达的神经元亚型减少，晚期超颗粒内端脑投射兴奋性和 Parvalbumin 表达的神经元减少，同时疾病相关的小胶质细胞和星形胶质细胞状态增加。研究团队发现了复杂的基因表达差异，从整体到细胞类型特异性影响。这些影响显示出不同的时间模式，表明随着疾病进展，细胞扰动各不相同。一部分捐赠者表现出特别严重的细胞和分子表型，这与更严重的认知衰退有关。作者在 SEA-AD.org 上创建了一个免费的公共资源来探索这些数据并加速 AD 研究的进展。 

实验设计

图1. SEA-AD 脑细胞图谱研究实验设计思路（选择邻近的脑组织切片进行神经病理学染色或基因组分析）。

MERFISH研究结果

结果一：绘制阿尔兹海默病患者的空间转录组数据图谱

为定义AD中超型的空间分布，本研究使用140个基因的基因panel对 SEA-AD供体子集进行了MERFISH分析，并开发了一种可靠的方法以获取不同疾病严重程度的高质量MERFISH数据（图2a）。经比较，每个供体整个组织切片的 MERFISH 转录本数量与Bulk RNA-seq的Pearson相关性为0.62；整个组织切片信号与分割细胞内的信号高度相关，并且MERFISH信号与Bulk RNA-seq也具有良好的相关性（图2b-d）；通过比较相邻切片的转录本数量来验证实验技术的高重复性（图2e，f）；通过比较亚类水平上测量基因的平均表达水平以评估snRNA-seq和MERFISH数据之间的基因表达高度对应性，也表明MERFISH数据的可靠性（图2g）。

为评估MERFISH数据中映射亚类和超型的能力，本研究使用所有基因的参考 snRNA-seq数据与MERFISH实验用到的gene panel模拟了映射准确性，结果显示，在任何一种情况下，子类级别的注释都非常准确，F1分数接近1（图2h）；在将MERFISH数据映射到亚类和超型后发现，亚类分布与CPS（定量疾病假进展）范围内供体的预期空间分布相匹配，例如兴奋性IT亚类仅限于皮质层，并且与先前研究中观察到的神经典型MTG组织的比例相匹配（图2i-j）；在MERFISH数据中也捕获到了snRNA-seq数据集中观察到的少突胶质细胞丰度的变化（图2k），说明MERFISH技术平台可以准确且可重复地绘制细胞亚类并证实snRNA-seq的数据结果。

图2. 用于在人类 MTG 中获取高质量空间转录组数据的pipeline。

结果二：阿尔兹海默病中易感和疾病相关超型

结合定量疾病假进展（CPS）、单细胞基因组学和空间转录组学数据可以识别AD的细胞和分子标志。为解答特定超型是否存在成比例的变化，作为疾病严重程度指标的函数，可以代表脆弱的细胞群或疾病相关的细胞状态，本研究使用一种贝叶斯方法scCODA以测试snRNA-seq和snMultiome数据集中认知状态、ADNC(AD神经病理学改变) 和CPS的变化。结果显示，多种神经元超型的丰度随着疾病严重程度的增加而减少，而几种高度特异性的非神经元超型的相对丰度增加，脆弱的神经元超型包括主要位于第 2/3 层（L2/3 IT）的端脑内（IT）神经元类型的子集，在非神经元受影响的群体中，一种小胶质细胞超型和一种星形胶质细胞超型增加，而一种Oligo少突胶质细胞和一种OPC少突胶质细胞超型减少（图3a）；不同细胞类型的丰度变化以不同的动态发生, 小胶质细胞和星形胶质细胞超型的增加很早就开始，并随着CPS的增加而继续增加, Sst中间神经元是最早受影响的神经元类型，在神经病理蛋白积聚之前就已减少（图3b）。

本研究使用MERFISH技术来验证这些发现，并了解受影响超型的空间分布。将超型丰度的变化与其空间转录组学数据的平均深度相关联，揭示了L2/3 IT类型的预期超粒度定位（图3c）。在匹配供体中，snRNA-seq和MERFISH数据集的相对丰度在整个ADNC中具有相关性（平均Pearson相关性为0.72，图3d），这揭示了MERFISH数据中受影响的Sst超型在CPS进展中表现出相似的持续下降。总之，这些数据证明了AD严重程度的强大且一致的细胞特征，该特征涉及选择性细胞群，这些细胞群在疾病进展过程中受到不同影响，并且优先在大脑皮质上颗粒层中受到影响。

图3. MTG中的脆弱群体集中在大脑皮质的上颗粒层周围。

MERFISH价值

1、构建单细胞分辨率的空间多模态细胞图谱：基于MERFISH技术定义AD不同细胞类型在疾病进展阶段的空间分布，以及AD进展过程中细胞类型比例的时空变化分析，从而构建人类大脑中AD的综合高分辨率多模式细胞图谱；

2、鉴定AD中易感和疾病相关的细胞超型：基于MERFISH技术分析特定细胞超型的空间分布，以特定细胞超型的比例变化为特征，作为疾病严重程度的指标。

2021年，Vizgen率先将整合了MERFISH与超分辨率成像技术的MERSCOPE分析系统推向市场。基于核心技术MERFISH技术，MERSCOPE可对最多3cm²的组织进行超分辨成像，分辨率100nm，定位单细胞中RNA的空间分布以及定量基因表达。实现真正意义上的原位单细胞空间转录组分析，让基因的表达和定位可视化，推动基因组学的研究步入下一代。

基因有限公司于2022年3月正式签约成为美国Vizgen公司MERSCOPE超分辨显微成像分析系统在中国区的合作伙伴。负责该仪器的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。同时，上海贝晶生物技术有限公司也提供MERFISH技术服务。想要了解关于更多有关MERFISH的技术信息，可添加下方微信。

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参考文献：Gabitto MI, Travaglini KJ, Rachleff VM, et al. Integrated multimodal cell atlas of Alzheimer's disease. Res Sq [Preprint]. 2023 May 23:rs.3.rs-2921860. doi: 10.21203/rs.3.rs-2921860/v1.