JACS | 北大刘涛/南开彭谦/地大娄筱叮团队在生物正交反应领域取得重要进展

　　

生物正交反应是一类能够在生理条件下进行，且不干扰正常生化代谢的连接反应。其极高的选择性（生物正交）且能连接两个反应物的性质使得该反应成为了生物研究中不可或缺的重要方法，最终该反应也成为了2023年诺贝尔化学奖的主题之一。随着该概念以及第一个生物正交反应的提出，越来越多的生物正交反应也在这二十多年间被陆续开发，在这其中，1,2,4,5-四嗪分子与反式环辛烯所发生的逆电子需求的Diels-Alder反应（iEDDA）由于其极快的反应速度脱颖而出，是一类该领域中颠覆性的生物正交反应。然而，由于生物体内广泛存在的亲核性分子，能够与反式环辛烯发生极快生物正交反应的四嗪分子（例如单取代的四嗪分子）往往在生物体内不稳定，甚至失去生物正交的能力。

针对以上目前生物正交反应领域的瓶颈问题，2024年8月20日，北京大学药学院天然药物及仿生药物全国重点实验室刘涛团队在Journal of the American Chemical Society杂志发表了题为Computational-Guided Discovery of Diazole Monosubstituted Tetrazines as Optimal Bioorthogonal Tools的研究论文。文章利用量子化学计算的方法确定了四嗪分子取代基的关键位阻区域，从而设计并合成出了一系列更小的基于五元二杂环的单取代四嗪分子，从理论和实验层面上证明了其打破了存在于四嗪分子中的反应性/稳定性的限制（图1）。利用这些开发的四嗪分子，在细胞以及动物体内实现了极高效的生物正交反应。

图1. 五元二杂环单取代四嗪分子打破了反应性/平衡性的限制（图片基于文章由作者绘制）

研究内容

1. 量子化学计算揭示打破四嗪分子反应性/平衡性的关键因素

单取代四嗪往往反应能力广泛且强，与普通的烯烃都能发生较快的反应，所以单取代四嗪能兼容的官能团很有限。目前绝大部分单取代四嗪的取代基都仅有芳香环或普通烷基构成，然而，刘涛团队通过理论计算发现了这两类最常用的单取代四嗪分子都存在各自的缺陷，最后提出了五元二杂环单取代四嗪分子是潜在的更好的，用于与反式环辛烯（TCO）反应的四嗪分子（图2）。

图2. 根据计算提出了元二杂环单取代四嗪分子（图片选自文章）

2. 实验验证五元二杂环单取代四嗪分子是潜在更好的生物正交工具

五元二杂环往往能够与金属离子配位，且容易被强亲核试剂所破坏，造成这类四嗪分子的合成相对困难。为了合成并表征这一系列四嗪分子，研究者们根据已有的四嗪合成路线开发了一种可以实现克级制备相应单取代四嗪分子的合成方法（图3），并且成功合成出了这些五元二杂环的单取代四嗪分子，而后通过实验验证了这些分子具有极高的反应性以及较好的稳定性（图4），其中咪唑类单取代四嗪（红色）的性质尤为突出。

图3. 开发的单取代四嗪分子合成方法

图4. 实验验证五元二杂环单取代四嗪分子的反应性以及稳定性（图片选自文章）

3. 咪唑单取代四嗪的基因遗传编码以及其在动物水平的用于标记优势的证明

研究者们后续利用基因密码子拓展技术将开发的咪唑单取代四嗪定点引入到了蛋白质上，并且在细胞膜表面实现了二级速率大于10的7次方的标记速度，仅使用1 nM染料在三十秒的情况下就能标记完全。同时也在动物水平证明了该四嗪分子的优势，由于其较高的稳定性和极快的反应速率，咪唑类单取代四嗪在动物体内存在6小时后仍然可以高效地被反式环辛烯染料标记，而其他的常见的“金标准”四嗪分子由于稳定性或者是反应性的问题在动物体内的标记效果都不好（图5）。

图5. 四嗪分子在动物水平标记效果的比较（图片选自文章）

4. 咪唑四嗪类分子可用于蛋白质的高效锚定

治疗蛋白质的锚定往往能解决很多药用蛋白免疫原性、半衰期、全身性毒性的问题。研究者们根据开发的咪唑单取代四嗪在动物体内用于标记的良好效果，将sfGFP、mCherry高效地锚定在了裸鼠的皮下，实现了7天的蛋白质的高效驻留，为后续药用蛋白的锚定策略提供了有力的方法（图6）。

图6. 基于咪唑类单取代四嗪的蛋白质锚定策略（图片截取自文章）

总结

该研究开发的新型五元二杂环单取代四嗪是生物正交工具包中十分有利的补充，尤其是其中的咪唑类四嗪分子，既有极高的反应速率，又具有较好的稳定性，使得其可以被遗传编码进入细胞的蛋白组中，成为真核细胞中最快的定点生物正交标签。该四嗪也在动物水平中展现了其强大的反应能力，比以往的“金标准”四嗪分子具有更好的标记效果，从而后续实现了高效的蛋白质锚定技术。

北京大学药学院刘涛教授、南开大学化学院彭谦教授、中国地质大学娄筱叮教授为本文的通讯作者。北京大学药学院2023级博士研究生李雨轩、2022级博士研究生苏晔宇为本文的共同第一作者，团队成员王浩宇、谢元哲、王昕、常丽颖、景彦博、张佳仪、马军安博士、金宏威博士为该研究做出了重要贡献。该研究获得中国国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家科技重大专项计划等项目的支持。

论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c07958

【刘涛教授简介】

刘涛，博士，北京大学药学院长聘教授，博士生导师，分子与细胞药理学系主任，天然药物及仿生药物国家重点实验室PI，化学生物学交叉中心PI，北大医学-惠大基因密码子创新联合实验室负责人。国家杰出青年基金获得者、国家优秀青年科学基金获得者、国家级人才计划青年项目获得者、北京市杰出青年基金获得者。任中国医药生物技术协会委员合成生物学分会委员，中国生物医学工程学会青工委委员，获中国药学会以岭生物医药青年奖，拜耳教授奖，北大王选青年学者奖等。以通讯作者身份在Nat Chem、Nat Chem Biol、Mol Cell、Sci Adv、JACS、Angew Chem、Chem等国际高水平期刊发表一系列研究论文。担任Journal of Molecular Biology编委，Chinese Chemical Letter编委等。研究集中在蛋白质药物化学修饰，基因编辑与细胞治疗，发展了含有人造氨基酸的蛋白质创新药物，应用在肿瘤及细胞治疗等多种领域，从而促进了生物药物的升级换代。

【彭谦教授简介】

彭谦，南开大学化学学院及元素有机化学国家重点实验室教授，博士生导师，国家“四青”人才，天津市杰青, 欧盟玛丽居里学者。2004年中山大学化学系获理学学士学位，2009年中科院上海有机所（导师吴云东院士）获有机化学博士学位。随后在美国圣母大学，德州农工和英国牛津大学分别进行理论计算化学研究。于2017年在入职南开大学化学学院，已在Acc. Chem. Res., J. Am. Chem. Soc., Nat.Commun.等国际权威期刊共发表学术论文70余篇。曾获国家自然科学二等奖（R5），欧盟玛丽居里奖，Thieme Chemistry Journals Award，2022年和2023年科睿唯安高被引科学家，2023年获南开化学教育教学优秀奖，中国化学会计算（机）化学专业委员会委员。先后主持国家级科研项目6项。任国家级本科精品/一流课程《结构化学》主讲教师，主持国家教改项目2项。主要研究领域面向稀土化学和不对称化学，研究有机反应的构象和电子自旋理论机制。

【娄筱叮教授简介】

娄筱叮，中国地质大学（武汉）材料与化学学院教授，博士生导师。获评中国分析测试协会科学技术奖CAIA奖一等奖（第一完成人），Sci. China Chem.、Chem. Eur. J 新锐科学家，Aggregate 期刊特别贡献奖，湖北省青年五四奖章，湖北化学化工学会优秀工作者，湖北省自然科学一等奖（第三完成人）。担任中青科协理事，全国青联委员，湖北省政协委员。主要研究方向为蛋白质活细胞分析及调控，场效应晶体管生物传感器件的构筑及应用等。近五年以通讯作者发表论文68篇，包括Nat. Chem.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Anal. Chem.、Natl. Sci. Rev.、Acc. Chem. Res.、Adv. Mater.、ACS Nano、 Nano Lett.等。全部论文引用10000余次，H 指数 59，1篇热点论文，15 篇论文入选 ESI 1%高被引论文，参编专著5部，获批国家授权发明专利12项，2项专利实现成果转化。与A股上市公司合作制作大型蛋白质在线检测设备，实现了30种蛋白质的在线检测。2017年获国家自然科学基金委优秀青年基金，2020年获批主持国家重点研发计划纳米科技专项青年项目，2021年获国家高层次人才特殊支持计划青年拔尖人才项目。

【第一作者简介】

李雨轩，北京大学药学院2023级博士研究生，研究兴趣为生物正交反应的优化与应用；在学期间以第一作者或共同作者身份在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Nat Comm., Chem., Nat. Chem. Biol..等杂志上发表多篇学术论文。

苏晔宇，北京大学药学院2022级博士研究生，研究兴趣为生物正交反应在生物医药领域的应用；在学期间以第一作者或共同作者身份在J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Nat Comm., Chem.等杂志上发表多篇学术论文。

天然药物及仿生药物全国重点实验室 供稿