10x Genomics Visium HD精彩揭秘：开启高清空间生物学之旅

全转录组空间基因表达是一种行之有效的方法，对于在组织结构内排成复杂网络的各种细胞类型，它能够从其分子表达谱中获得深刻的无偏见解。以无偏的全转录组基因表达分析为基础，这种空间生物学方法为研究人员带来了巨大的发现潜力。

除了建立组织的空间分辨细胞图谱，全转录组空间见解还有助于鉴定稀有的细胞表型和细胞间相互作用，这些表型和互作在健康和疾病过程中发挥了关键作用(1-3)。一个有力的例子是，研究人员在人体气管的黏膜下腺体中追踪到一群分泌IgA抗体的浆细胞，它们可能支持了抗病毒呼吸免疫中的免疫细胞招募和抗体分泌(1)。

全转录组空间分析还发现，在同一名患者的肿瘤样本中，一种罕见的前列腺癌亚型与更常见的亚型并存，对这两种亚型的差异基因表达分析为开发诊断和潜在治疗方案提供了指导(2)。

在一项采用新辅助疗法cabozantinib和PD-1抑制剂nivolumab来治疗肝癌的1b期临床试验中，约翰霍普金斯大学的研究人员对患者样本进行了全转录组空间分析，在与肿瘤相邻的免疫细胞区域发现了受转录因子PAX5调控的B细胞活性增强，可作为积极治疗应答的重要生物标志物(3)。

这些有力的例子证明了全转录组空间基因表达的价值，它能够全面表征复杂的生物系统，并提出可操作的临床相关假设，以便进一步检验和验证。然而，尽管有了这些杰出的成果，生物学世界仍然隐藏着许多秘密。全转录组发现能力相同但分辨率更高的空间分析工具的出现，可确保研究人员能够全面详细地了解样本的复杂性。

这就是Visium HD空间基因表达有望开创空间生物学发现新时代的原因，它以单细胞级分辨率提供全转录组见解。Visium HD采用新的载玻片结构和Visium CytAssist支持的工作流程，可从人类或小鼠FFPE组织样本中获得最佳的高分辨率空间转录组学数据，实现v1和v2版本的Visium分析所展示的强大发现能力。

作为有史以来呼声最高的产品，我们非常兴奋和自豪地在最近召开的网络研讨会上向您介绍Visium HD。您可以扫描下方二维码观看研讨会的回放视频，也可以阅读下文了解会议梗概：

part 1

「Visium HD工作原理」

Visium HD工作流程类似于v2版本CytAssist支持的Visium空间基因表达工作流程。这个流程将标准的组织学过程与简单的分子生物学方案相结合，在获取组织切片的H&E或IF图像的同时，获取单细胞尺度的全转录组空间基因表达读数。

这个工作流程可以从FFPE组织块和新鲜制备的切片开始，也可从预先切片的组织载玻片开始。这种FFPE兼容性让研究人员可以分析存档样本。在H&E或IF染色步骤后，利用全转录组探针组合来处理组织，实现探针对与其靶点的杂交和连接。之后，CytAssist支持的工作流程可将基因表达探针从组织切片转移到Visium HD玻片上（图1）。

图1. 探针从玻璃载玻片上的FFPE组织切片转移到Visium HD玻片上的示意图，这个过程由CytAssist仪器协助完成。将组织载玻片和Visium HD玻片上样到Visium CytAssist仪器中，让它们彼此靠近。基因表达探针从组织中释放出来后，被Visium玻片表面水凝胶中带有空间条形码的寡核苷酸捕获。

Visium HD玻片捕获区的结构是该分析能提供高分辨率空间见解的关键因素（图2）。在捕获区内，寡核苷酸连续排列在数百万个2 x 2 µm条形码标记的正方形中，用于捕获基因表达探针。寡核苷酸中的空间条形码有助于将基因表达读数映射回组织切片图像中。

图2. Visium HD玻片结构的示意图。Visium HD玻片包含两个6.5 x 6.5 mm捕获区，其中寡核苷酸连续排列在数百万个无间隙的2 x 2 µm条形码标记的正方形中，实现单细胞级空间分辨率。数据以2 µm单位以及多个合并的分析单位输出。8 x 8 µm大小的分析单位是可视化和分析的推荐起点。

在探针捕获和空间标记步骤结束后，从Visium CytAssist中取出Visium HD玻片，进行下游文库制备。从每个组织切片中生成基因表达文库并进行测序。这种基于测序的空间分辨全转录组基因表达读数以2 µm为单位输出，同时提供多个合并单位的读数。这种基因表达数据可叠加到匹配的H&E或IF组织图像上进行可视化和探索。

关于Visium HD分辨率和合并单位的更多信息：合并单位可以小到足以捕获单个细胞，这就意味着这种方法能够表征每个合并单位中存在的主要细胞类型。考虑到这种合并策略和真核细胞的平均大小（介于8-100 µm），每个合并区域可能覆盖不止一个细胞的组分；因此，Visium HD提供了我们所说的单细胞级空间分辨率。2 µm数据可用于自定义合并，以便与组织形态相匹配。我们的分析指南(4)举例说明了如何实现这一点。

part 2

「运行Visium HD为什么需要CytAssist仪器」

Visium CytAssist允许科学家们在玻璃载玻片上新鲜制备组织切片，或从预先切片的组织开始空间实验，让空间样本管理变得更容易。它也是Visium HD工作流程的重要组成部分，因为它支持自动而精准的探针转移和空间标记。该仪器为探针从组织载玻片转移到Visium HD玻片上提供了可控的环境，最大限度地减少了扩散和液体流动等过程，并最大限度地提高了条形码分配的准确性。这确保了最大数量的探针靶点被捕获，并以最高的空间保真度对其进行定位。

Visium HD耗材和分析流程的设计也是为了最大限度地提高转录本定位的准确性。条形码标记的正方形之间没有间隙，进一步确保了捕获的靶点分子具有高的定位准确性。

在以单细胞分辨率探究精细解剖结构和复杂细胞生态位中的空间生物学时，这种可靠的过程和随后的数据可信度就显得尤为重要（图3）。

图3. 这个例子说明了为什么在更高的分辨率下需要通过精确的转录本定位来保持高的空间保真度。本图中，FFPE小鼠肠道的Visium HD数据显示了潘氏细胞基因表达特征的精确空间定位，出现在预期的形态区域。

part 3

「Visium HD相对于之前的产品有何改进之处」

在这种情况下，一张图片胜过千言万语：

图4. FFPE人类结直肠癌样本的Visium v2数据（左）和Visium HD数据（右）的并排比较，展示了在单细胞分辨率下全转录组空间基因表达的发现能力增强。

在比较Visium v2和Visium HD分析时，分辨率是最显而易见的改进，因为Visium HD能够从结构复杂的组织切片中捕获大量的空间细节。利用基于图像的聚类，研究人员有望从Visium HD空间基因表达数据中获得更精细的细胞类型注释。

基因表达灵敏度因组织类型而异。在测序深度匹配时，Visium HD的灵敏度通常与Visium v2相当（图5）。然而，Visium HD的连续覆盖和更高分辨率可以将这些转录本更精细地分配到组织中的某个位置。

图5. 图中展示了Visium HD和v2分析的灵敏度相当。

尽管我们计划为Visium HD分析提供更多的组织制备和化学方法，但我们的v1新鲜冷冻Visium空间基因表达分析采用了基于逆转录的化学方法，因此不受物种限制，是在大鼠或斑马鱼等不常见的动物模型中开展全转录组空间转录组学分析的良好选择。此外，v2 Visium CytAssist空间基因和蛋白表达分析可以测定同一张FFPE组织切片的全转录组基因表达和高度多重的蛋白质表达(5)，为您当前的研究增添价值。

part 4

「Visium HD已经测试过的组织类型」

Visium HD与人类和小鼠的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织兼容。Visium HD空间基因表达测试组织列表详细列出了内部测试过的组织类型(6)，以及我们建议处理时注意的重要事项。这并不是一份限制性的兼容组织列表，因此如果您感兴趣的组织不在列表中，并不意味着它不兼容。它只是未经过测试而已！一般来说，如果某种组织类型曾使用v2 Visium CytAssist空间基因表达成功分析，我们预计它也适用于Visium HD。

图6. Visium HD分析测试过的人类和小鼠FFPE组织。值得注意的是，一些颇有挑战性的组织样本（如人类脾脏）已通过Visium HD的测试和验证。组织芯片（TMA）也与Visium HD兼容。

存档的临床样本也是经过测试与Visium HD兼容的FFPE样本之一，包括FFPE组织块或预先切片的组织。Visium HD不采用特殊方案来处理特定组织类型或条件，而是采用通用的FFPE兼容方案，不需要额外优化。此方案已在各种FFPE组织保存条件下得到验证，包括新鲜切片的组织、存档组织和盖玻片下的组织。

我们还发布了公开的Visium HD数据集(7)，供大家自行探索！其中包括人类FFPE结肠癌和肺癌样本的数据，以及小鼠FFPE肠道和大脑样本的数据。

part 5

「关于Visium HD的常见问题」

在我们最近召开的介绍Visium HD的网络研讨会上，10x Genomics高级产品经理Julia Cowen博士、10x Genomics分子生物学高级科学家Naishitha Anaparthy博士和客户讲者、Wellcome Sanger研究所的团队负责人Omer Bayraktar博士回答了一些问题，关于Visium HD分析、工作原理、兼容样本类型及其不断发展的功能。我们将在下文中重点介绍几个有关Visium HD的问题。

Visium HD常见问题解答

Q：Visium HD适用于10年前的FFPE存档样本吗？在开展分析之前要如何测试？

A：Julia Cowen：我们测试过保存了6个月的样本，但还没有测试过最大的保存年限。对于v2产品，我们看到客户超越了这个范围，样本保存年限长达数月甚至数年，因此我们也期待有类似的性能。

您可以开展的测试是评估DV200值，以了解RNA质量，并确保其大于30%，再进行组织处理。这可以在您运行Visium HD之前提供一个质量控制指标。

Q：Visium HD所使用的组织切片在厚度上是否有限制？

A：Naishitha Anaparthy：目前我们支持厚度为3–10 µm的切片。我们在此范围内进行了测试。我们内部使用的标准切片厚度为5 μm。

Q：Visium HD的建议测序深度是多少？

A：Julia Cowen：对于完全覆盖的捕获区，也就是组织切片覆盖整个捕获区，我们建议至少有2.75亿对读数。这也取决于您的研究问题——回答您的问题需要什么样的测序饱和度，取决于您的组织块和组织类型。对于富含RNA的样本，增加测序读数可以获得更多信息。因此，许多客户可能会选择高出最低的建议值，以便在利用Visium HD分析其组织样本时获得最高的灵敏度。

Q：2 μm和8 μm合并单位是什么原理？为什么建议以8 μm合并单位进行数据分析？

A：Omer Bayraktar：在您生成HD数据集时，您可以访问2 µm数据。不过，为了更适合计算——确保有足够的转录本可处理——数据可合并成4x4的单位，也就是8 x 8 µm。

Julia Cowen：没错，我可以确认我们提供了2 µm级别的数据，而且还提供了几种不同的合并单位。例如，研究人员可通过Space Ranger将数据重新组合成10 µm到100 µm之间（2 µm的整数倍）。Space Ranger生成的Loupe文件可以8 µm合并单位或自定义的合并单位提供。

一般来说，与2 µm条形码标记的正方形相比，8 µm合并单位的优势在于每个单位包含更多的转录本——这提高了聚类和评估差异基因表达的统计能力——同时仍然能提供单细胞级分辨率，因为大多数哺乳动物细胞的直径在8–100 µm之间。因此，我们认为这是分析Visium HD数据的良好起点。

Q：从H&E组织图像中获得的细胞分割信息是否可用于数据解卷积并获得单细胞样信号？

A：Omer Bayraktar：这是一个好问题，我对这个问题中的描述感到非常兴奋。有了Visium，您显然就有了匹配的H&E图像，而有了CytAssist，您现在可以看到福尔马林固定组织的H&E图像，它们往往呈现出高的形态学质量。因此，我认为有了HD，完全可以试试先查看图像，分割细胞，然后（以最精细的分辨率——2 µm）对Visium HD像素点进行计数或分配到单个细胞中。这项工作完全独立于*spaceTree解卷积。

目前，这种做法是否适用于每个组织样本取决于组织本身、H&E图像的清晰度以及细胞分割的质量。有些组织和细胞能很好地从H&E图像中分割出来。对于胶质母细胞瘤，分割质量也可以接受。不过对于某些组织，这可能会相当困难，比如特别致密、细胞密集或存在多种不同细胞状态的组织。例如，肝脏可能很难进行单细胞分割。因此，对于这方面感兴趣的人，我建议首先关注分割质量，通过肉眼观察来确认您是否获得了接近单细胞类型的数据。留意可能因分割效果不佳而遗漏的细胞群，或进行良好的细胞分割质控，如寻找双细胞（doublets）。但我认为，对于这类数据而言，这是一种令人兴奋的方法。

*在我们最近召开的网络研讨会上，Bayraktar博士介绍了他的合作者开发的计算模型spaceTree，该模型能够对高分辨率空间转录组学数据和单细胞RNA测序参考数据集进行可扩展的整合。利用这一工具对Visium HD数据进行解卷积，有助于鉴定组织生态位，或对带有单细胞参考图谱的肿瘤亚克隆进行空间定位。

欢迎阅读我们新发布的分析指南(4)，了解Visium HD数据的细胞核分割和自定义合并。

part 6

「Visium HD将如何推进空间发现研究」

Visium HD是基于v2 Visium的全转录组空间发现能力，而许多研究人员在其项目中已经了解并重视这种能力(1-3)。它通过提供最高分辨率的空间基因表达视图以及连续的组织覆盖，提升了这些空间见解，并丰富了每个实验的内涵。Visium HD玻片捕获区的条形码标记正方形之间没有间隙，因此不会遗漏珍贵样本中的任何生物信息。FFPE样本的无偏完整视图有望揭示空间和细胞上复杂的组织微环境中的生物学见解，这些见解以往可能被忽视或无法发现。

在我们的网络研讨会上，Wellcome Sanger研究所的团队负责人Omer Bayraktar博士讨论了他们团队如何确定胶质母细胞瘤（GBM）的异质性恶性细胞状态的轨迹，这是一种致命脑癌。在肿瘤内部和患者之间，胶质母细胞瘤中的恶性细胞是高度多样化的，驱动了GBM特有的各种肿瘤亚型；然而，调控其细胞轨迹的机制还不清楚。Bayraktar博士及其团队对数十个患者肿瘤样本使用了整合多组学方法，包括单细胞核RNA-seq和ATAC-seq、Visium空间基因表达和Xenium原位分析，构建了一份全面的GBM恶性和肿瘤微环境（TME）细胞状态图谱，并绘制了恶性细胞状态的空间分区。

有了Visium HD，他们如今能够绘制出一份更精细的人类FFPE GBM样本的全转录组基因表达图谱，在解剖上更为详细。这些数据提供了关键解剖学特征的更高分辨率视图（包括小血管），以及同一份肿瘤样本中恶性细胞状态之间的空间转换——特别是揭示了肿瘤区域内恶性细胞状态的混合（以往未发现），这些区域乍一看似乎是由单一恶性细胞类型为主。如果没有更高分辨率的组织视图，这一发现是不可能实现的。

Visium HD还揭示了富含缺氧和血管生成特征的肿瘤相关巨噬细胞和缺氧性恶性肿瘤细胞状态的空间共定位，为可能的功能关系提供了见解，有助于Bayraktar博士的团队了解这些细胞状态中的缺氧反应式如何诱发的。

这仅仅是体现高分辨率全转录组空间基因表达的发现能力的一个例子。在回顾客户利用我们的v1和v2 Visium分析开展的科学研究后（一些研究收录在2023年我们最喜爱的Visium文献中），我们可以想象Visium HD将为更多同样令人惊叹的研究提供动力。

part 7

「Visium HD带您迈入空间发现的新时代」

我们介绍Visium HD时的激动心情远远不及我们对您将如何利用这项技术改变生物学并对人类健康带来突破性进展的兴奋与期待之情。我们希望，Visium HD能够成为您手中的工具，为空间发现的新时代提供动力，并为基于测序的空间生物学和数据分析领域不断创新提供平台。

随着科学家们开始将Visium HD应用在他们的项目中，我们鼓励您探索我们现有的Visium HD资源，以便了解最新情况。我们的人类和小鼠FFPE数据集是一个宝贵工具，可以让您了解Visium HD分析的输出结果以及它能为您的研究带来哪些成果。如果您已经准备好了，欢迎查看Visium HD用户指南及其他支持文档(8)。

如果您对我们的产品和技术感兴趣

欢迎扫码留下联系方式

参考资源：

Madissoon E, et al. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet 55: 66–77 (2022). doi: 10.1038/s41588-022-01243-4

Watanabe R, et al. Spatial gene expression analysis reveals characteristic gene expression patterns of de novo neuroendocrine prostate cancer coexisting with androgen receptor pathway prostate cancer. Int J Mol Sci 24: 8955 (2023).

Zhang S, et al. Spatial transcriptomics analysis of neoadjuvant cabozantinib and nivolumab in advanced hepatocellular carcinoma identifies independent mechanisms of resistance and recurrence. bioRxiv (2023). doi: 10.1101/2023.01.10.523481

https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/segmentation-visium-hd

https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-and-protein-expression

https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-hd/documentation/steps/experimental-design-and-planning/visium-hd-spatial-gene-expression-tested-tissues

https://www.10xgenomics.com/datasets?query=&page=1&configure%5BhitsPerPage%5D=50&configure%5BmaxValuesPerFacet%5D=1000&refinementList%5Bsoftware.name%5D%5B0%5D=Space%20Ranger

https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-hd