探秘自动化显微镜：如何高效进行荧光染色的贴壁细胞成像与计数

Introduction

基于细胞的分析是药物发现和开发研究的基础。细胞计数作为一种规范实验条件和数据以及监测细胞健康的方法，是细胞相关检测中重要质量控制参数。

CELENA®X自动化成像系统直接从孔板捕获和分析贴壁细胞的图像以实现高通量的细胞计数，对孔板进行多达四个荧光通道的成像，结合CELENA® X Cell Analyzer软件，评估拍摄图像的多种参数和分析细胞表型。在本次测试中，我们通过吖啶橙和Hoechst 33342双染色HEK293细胞来研究CELENA®X的细胞计数能力。

细胞准备

用LUNA-II™自动细胞计数仪计数HEK293细胞，以1 ×10⁴ 个细胞/孔的密度接种到96孔板中，培养过夜。用PBS洗涤细胞，在100 μL 4% PFA中室温固定15分钟，然后用PBS洗涤2次。细胞染色时，每孔加入100 μL吖啶橙(Logos Biosystems, F23002)，室温孵育15分钟。PBS洗涤每孔2次后，每孔加入100 μL 4 μg/mL Hoechst 33342 (Life Technologies, H3570)，室温孵育15分钟。成像前用PBS洗涤两次细胞以去除多余的染色。

成像和分析

01 成像

使用CELENA®X自动化成像系统，使用10倍LWD高NA物镜和基于图像的自动对焦，从96孔板的60个孔中获取Brightfield, GFP和DAPI图像。

02 分析

使用CELENA® X Cell Analyzer软件进行细胞计数是基于从指定通道使用IdentifyPrimaryObjects模块识别细胞核或整个细胞。细胞核很容易被识别，因为它们形状均匀，染色后与背景有很高的对比，并且与邻近的细胞核间隔很好。吖啶橙(GFP)和Hoechst (DAPI)都是染色细胞核的荧光染料，Hoechst染色细胞核明显，但是吖啶橙遍布细胞质。为了识别每种染料染色的细胞，顺序使用两个IdentifyPrimaryObjects模块。表1显示了针对每种染料对IdentifyPrimaryObjects模块进行的建议调整。如图1所示，软件精准地识别并分割了在两个通道下成像的细胞。

图1. 高内涵贴壁细胞计数。HEK293细胞的示例图像，细胞核用Hoeschst 33342和吖啶橙标记，然后用细胞分析仪软件使用IdentifyPrimaryObjects模块进行分割。

表1. IdentifyPrimaryObjects高级设置，用于识别细胞和确定细胞数目。（Hoechst：识别含有蓝色荧光的所有对象，定义单个细胞核；吖啶橙：识别含有绿色荧光信号的所有细胞，识别单个细胞）

结果

结果表明，通过两种不同的染色方法对细胞进行标记，经CELENA X自动化地拍摄和分析后得到的结果高度一致。

图2. 由IdentifyPrimaryObjects模块统计的细胞数目。(A) Hoechst 33342和吖啶橙染色导致每孔中计数的细胞数量相同或相似。(B)取每孔细胞数平均值时，两种染色方法无显著差异(注:无显著差异)。

结论

在本研究中，我们展示了使用CELENA®X自动化成像系统对贴壁细胞进行计数是多么简单。使用CELENA®X进行荧光细胞成像与自动对象识别和定量配对，为研究人员提供了一种简单灵活的方法来监测各种基于细胞的测定。可以重复使用相同的分析管道来验证或比较结果，使CELENA®X成为基于细胞的分析的强大工具。

参考文献：

Choudhry P. 2016. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS ONE, 11(2): e0148469.

Mandavilli BS, Aggeler RJ, Chambers KM. 2018. Tools to measure cell health and cytotoxicity using high content imaging and analysis. Methods Mol Biol, 1683: 33-46.

O'Brien PJ, Irwin W, Diaz D, Howard-Cofield E, Krejsa CM, Slaughter MR, Gao B, Kaludercic N, Angeline A, Bernardi P, Brain P, Hougham C.2006. High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening. Arch Toxicol, 80: 580-604.

产品介绍   

CELENA®X拥有基于图像和激光的自动对焦模块，以及全电动的XYZ移动载物台，大大简化了多孔板扫描以及切片扫描的时间。无论简单的固定细胞分析还是复杂的、延时活细胞分析，强大而灵活的软件都可以让你建立高级图像分析程序，用来定量分析固定细胞和活细胞的特征。CELENA®X是药物发现与生命科学研究的有利工具。

自动化成像系统

01 四种成像模式

 4通道荧光、明场、彩色明场、相差成像。

02 全自动的孔板扫描

 全自动的孔板扫描，电动XYZ载物台，自动的光源、荧光通道和物镜切换。

03 基于激光的快速自动对焦

 除了基于图像的自动聚焦还支持基于激光的快速和可重复的自动聚焦，减少光毒性和光漂白，加快拍摄速度。

04 强大易用的采集和分析软件

 简单直观的成像protocol设置，与分析流程无缝衔接。

05 自定义的高内涵分析

 自定义的高内涵分析流程，基于表型批量分析多通道成像图片。

06 支持活细胞成像

 载物台孵育系统适适用于各种生理或非生理条件下的成像实验。

07 多种配件可选

多种适配器：

  显微玻片、腔室玻片、各种规格培养瓶、培养皿、6-1536多孔板。

多种物镜：

  1.25-100x放大倍数的空气镜或油镜可选。

可置换荧光光立方：

  12种不同波段的光立方，覆盖市面上常见的荧光染料的波长，支持特殊波段光立方定制，用户可在实验室自主完成滤镜更换。

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