钙离子瞬时变化的快速捕获与批量分析

钙是所有生物体中必需的元素，对细胞多种功能至关重要。钙离子通过钙离子通道跨膜迁移，进而激活或抑制多种酶[1-3]。钙离子负责肌肉的放松和收缩、血管的收缩和舒张、神经信号传递以及激素分泌[4-6]。本研究通过添加ATP激动剂来评估牛主动脉内皮细胞（BAEC）细胞内钙离子流动条件的变化[7]。Fluo-8® AM是一种可用作荧光指示剂的乙酰甲酯，在钙离子存在下于细胞内水解。使用Fluo-8® AM和ATP激动剂组合来检测活细胞中细胞内钙离子流出水平的变化。设置了3分钟的时间间隔来监测由ATP激动剂激活的BAEC细胞内钙外流，迫使细胞间G蛋白偶联受体释放细胞内钙离子[8]。

关键点

01 使用CELENA® X自动化显微镜系统进行膜电位的高通量筛选。

02 ATP诱导Fluo-8® AM酯化物进入活细胞，用于动态活细胞成像。

03 优化的分析流程，用于评估ATP诱导的细胞内钙离子流动。

实验准备

本应用将牛主动脉内皮细胞(BAEC)与Fluo-8® AM结合，Fluo-8® AM是一种细胞渗透性钙指示剂。BAEC是一种较好的内皮细胞系，可有效提供模型测量细胞特征的钙渗透性。为了评估钙离子流出，首先将健康的BAEC以 20,000 个细胞/100μl/孔接种在含有 10% 胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基中过夜，在96孔板（SPL，30296）中培养16小时。吸出培养基，分别加入5μM的Fluo-8®AM和2.5 mM的ReadiUse™丙磺舒，置于室温(避光)的HHBs中孵育1小时(AATbio.com Cat. 21080 & Cat. 20062)。然后，除去培养基，并根据制造商的说明用100μL DPBS 清洗孔。预先配制500μM ATP的DPBS，并将20 μl ATP加入到96孔板的每孔中，使 ATP 终浓度为 20μM（Fishersci，Cat AC1028001000）。

成像和分析

01 成像

为了获取图像，将细胞板放置在 CELENA® X 系统的载物台上，并设置3分钟CELENA® X Explorer 延时扫描成像，捕捉速度设置为每秒 4 张图像（4 fps），使用10倍物镜。将20μl准备好的 ATP 原液轻轻滴加到板的每个孔后立即开始扫描。

02 分析

①AddsingleImage模块来选择用于创建掩模的图像（时间0）

②IdentifyprimaryObjects模块通过荧光信号的边界查找时间0图像中的单个细胞。

③MaskImage 模块使用上一步中识别的对象来掩盖图像

④MeasureObjectIntensity 模块用于测量和量化荧光强度

⑤GrayToColor 模块将单色图像转换为绿色伪彩色图像

⑥OverlayOutlines 模块绘制每个细胞的轮廓

结果

分析自动生成的定量.CSV文件包含了细胞信号强度，根据文件中的数据绘制了所有细胞和几个代表细胞的钙动员随时间的变化（图 1）。选定的细胞内钙变化延时图像在0秒、10秒、20秒、40秒和160秒呈现，显示了Fluo-8®信号在10至40秒内引发更高水平的瞬态变化。细胞内钙离子响应荧光的最大总强度在35秒处（图 F）。

图1. ATP依赖性钙外排的延时测定。20µM ATP试剂(A-E)处理后，钙动员Fluo-8®荧光信号的延时图像。在ATP激动剂处理下，(F)图中绘制了三个典型的细胞荧光信号的变化，基于整张图像(A-E)钙信号变化在(G)图中表示。

结论

在ATP存在的情况下，细胞内钙离子瞬时增加，然后在2-3分钟内逐渐恢复到基线水平。基于3分钟内测量的强度，结果代表了随时间变化的钙值和180秒内10-40秒的峰值高度[9]。由于反应发生的时间非常短，应使用多通道移液器将激动剂同步加到孔中。Fluo-8® AM的钙离子流动在波长Ex/Em=490/525下被检测。[钙离子流动测量]分析pipeline在CELENA® X Analyzer中构建，适用追踪特定细胞的时间或Z轴序列图像中的荧光强度变化。

参考文献：

1. Hahn, K., R. DeBiasio, and D.L. Taylor, Patterns of elevated free calcium and calmodulin activation in living cells. Nature, 1992. 359(6397): p.736-8.

2. Vofely, G., et al., Characterization of calcium signals in human induced pluripotent stem cell-derived dentate gyrus neuronal progenitors and mature neurons, stably expressing an advanced calcium indicator protein. Mol Cell Neurosci, 2018. 88: p. 222-230.

3. Regehr, W.G., J.A. Connor, and D.W. Tank, Optical imaging of calcium accumulation in hippocampal pyramidal cells during synaptic activation. Nature, 1989. 341(6242): p. 533-6.

4. Zhao, Z., et al., Modulation of intracellular calcium waves and triggered activities by mitochondrial ca flux in mouse cardiomyocytes. PLoS One, 2013. 8(11): p. e80574.

5. Svenningsen, P., J.L. Burford, and J. Peti-Peterdi, ATP releasing connexin 30 hemichannels mediate flow-induced calcium signaling in the collecting duct. Front Physiol, 2013. 4: p. 292.

6. Ainbinder, A., et al., Role of Mitofusin-2 in mitochondrial localization and calcium uptake in skeletal muscle. Cell Calcium, 2015. 57(1): p. 14-24.

7. D'Hondt, C., B. Himpens, and G. Bultynck, Mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells. J Vis Exp, 2013(77): p. e50443.

8. Caers, J., et al., Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J Vis Exp, 2014(89): p. e51516.

9. Rand, M.N., et al., Calcium signals in neurons. Nature, 1994. 371(6495): p. 291-2.www.logosbio.com

产品介绍   

CELENA®X拥有基于图像和激光的自动对焦模块，以及全电动的XYZ移动载物台，大大简化了多孔板扫描以及切片扫描的时间。无论简单的固定细胞分析还是复杂的、延时活细胞分析，强大而灵活的软件都可以让你建立高级图像分析程序，用来定量分析固定细胞和活细胞的特征。CELENA®X是药物发现与生命科学研究的有利工具。

自动化成像系统

01 四种成像模式

4通道荧光、明场、彩色明场、相差成像。

02 全自动的孔板扫描

全自动的孔板扫描，电动XYZ载物台，自动的光源、荧光通道和物镜切换。

03 基于激光的快速自动对焦

除了基于图像的自动聚焦还支持基于激光的快速和可重复的自动聚焦，减少光毒性和光漂白，加快拍摄速度。

04 强大易用的采集和分析软件

简单直观的成像protocol设置，与分析流程无缝衔接。

05 自定义的高内涵分析

自定义的高内涵分析流程，基于表型批量分析多通道成像图片。

06 支持活细胞成像

载物台孵育系统适适用于各种生理或非生理条件下的成像实验。

07 多种配件可选

多种适配器：

  显微玻片、腔室玻片、各种规格培养瓶、培养皿、6-1536多孔板。

多种物镜：

  1.25-100x放大倍数的空气镜或油镜可选。

可置换荧光光立方：

  12种不同波段的光立方，覆盖市面上常见的荧光染料的波长，支持特殊波段光立方定制，用户可在实验室自主完成滤镜更换。

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关于基因

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