你做的定量Western Blot结果准确吗？

Western Blot是定量 or 定性？

虽然Western Blot最初是一种定性方法，或者充其量是一种半定量方法，但随着计算系统生物学的兴起，蛋白质印迹对于完全定量的应用变得越来越重要。实验人员可以使用定性蛋白质印迹法来鉴定目标蛋白的存在与否。也可以使用定量蛋白质印迹法用于检测特定蛋白质并测量不同条件之间的相对变化。无论是定量、定性或半定量，这都是相对的，因为没有绝对的测量。关键是要最大限度地提高准确性和精确度，使相对尽可能有意义。那如何尽可能减少可变性呢？此篇文章主要论述从Western Blot方法学和成像仪器的选择上来减少可变性。

化学发光or荧光检测？

ECL检测

增强型化学发光 （ECL） 是一种使用辣根过氧化物酶(HRP) 标记二抗的间接检测方法。 HRP是一种与底物反应产生光子的酶。光被胶片或数字成像仪检测到的信号形成定量的数据。此时需要特别注意，酶和底物动力学及时间问题。对于ECL来说，由于酶促反应的动力学会影响信号强度，因此信号并不总是准确反映蛋白丰度。不同目标信号之间的比例在不断变化。你得到的结果取决于你什么时候成像。因此，使用ECL成像时，时机很重要。

荧光检测

荧光检测是获得比例信号的最简单方法。使用IRDye近红外（NIR）荧光染料标记的二抗进行直接检测。这些近红外荧光信号可稳定数月，无需使用酶或底物。荧光信号的强度不受曝光时间的影响，从而使定量Western Blot结果更加一致和可靠。荧光染料的稳定信号帮助实验人员实验过程中去除了一个变量。

可见荧光or近红外荧光？

定量Western Blot常用的PVDF膜和NC膜在可见荧光下，有很强的自发背景荧光，而在近红外荧光背景下自发荧光可忽略不计（图1）。在可见荧光下，背景荧光过高会掩盖蛋白条带的真实信息，导致定量数据不准确（图2）。近红外荧光成像在成像的方法上帮助实验人员除去一个变量。

图1. PVDF膜和NC膜在可见光荧光及近红外荧光下自发荧光对比结果

图2. 使用可见荧光和近红外荧光进行Western Blot成像结果对比

多重检测

通过多重检测，可以在同一膜上同时检测两个及以上蛋白。当蛋白分子量相差不大时，可使用两种不同的染料标记二抗进行双色近红外检测。该方法特别适用于研究蛋白翻译后修饰，如：甲基化，磷酸化等。使用多种抗体进行荧光免疫印迹使内部对照的标准化更简单、更方便、更准确。省去了膜上抗体的剥离和再孵育过程，帮助实验人员在实验操作过程中减少一个变量。

图3. LI-COR Odyssey DLx双色激光成像系统成像结果

除了在方法学上选择近红外荧光以外，定量Western Blot还得考虑两个主要问题：

1、信号与上样的蛋白质量是否成正比？

2、目标蛋白质和内参蛋白是否在线性范围内进行定量？

针对以上两个问题，在选择成像仪器上至关重要。

ECL or LI-COR？

将Hdm2、HdmX和p53三种蛋白以2倍浓度递进稀释上样，分别对比LI-COR和ECL对其的定量结果。结果表明，在LI-COR红外激光成像系统上，信号与上样的蛋白质量之间呈现出更好的线性关系。其最高的变异系数R2值为0.9936，显示出了出色的定量精度（图4）。

图4. LI-COR Odyssey CLx和ECL定量结果对比¹

其他仪器 or LI-COR Odyssey？

无饱和的高灵敏度是宽线性动态范围的关键。LI-COR Odyssey红外激光成像凭借宽广的动态范围（≥6个数量级）和线性范围帮助在成像时确保在检测弱信号时强信号不过曝（图5）。该系统采用窄带宽光的固态激光器，有效减少了非特异性漫射白光引起的漏光，从而消除背景干扰并进一步提高了仪器的灵敏度（见图6）。此外，配合与顶级杂志期刊开发的Empiria Studio®软件中线性范围验证，能够显示最佳样品上样范围，从而确保目标蛋白质和内参蛋白能够在线性范围内进行定量。选择LI-COR Odyssey使得检测系统不再是定量Western Blot的限制因素。

图5. LI-COR Odyssey、其他化学发光成像仪和压片成像动态范围结果比较

图6. 固态激光器与LED和白光光源的Western Blot成像结果对比

实战表现

图7. 删除baz-2或者set-6，H3K9me3水平降低，但是H3K9me1和H3K9me2水平没有降低。在N2，baz-2, baz-2和set-6， set-6秀丽隐杆线蠕虫模型中，H3K9甲基化水平代表性的定量Western Blot结果（左侧）定量分析结果（右侧）²；审稿人反馈意见。

为实现精准的Western Blot结果定量，作者在主图数据中采用Odyssey双色红外激光成像系统做定量Western Blot，数据结果可靠，得到作者和审稿人的一致认可。Odyssey双色红外激光成像系统进行定量Western Blot检测，与化学发光方法相比动态范围更宽，因此可实现准确定量，助力本研究登上Nature杂志。

结论

选择LI-COR Odyssey红外激光成像系统，可以从方法学和成像上减少定量Western Blot中的变量，保证实验的准确性和一致性。

参考文献：

1.Wang Y V, Wade M, Wong E, et al. Quantitative analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for p53 activation.[J]. Proceedings of the National Academy of Science, 2007, 30(1):17-25.

2.Jie Yuan,Si-Yuan Chang, Shi-Gang Yin. et al. 2020. Two conserved epigenetic regulators prevent healthy ageing. Nature. volume 579, pages118–122(2020)   

Odyssey® 家族

LI-COR Biosciences公司的Odyssey® 红外激光成像系统可以实现定量Western Blot检测，具有重复性好、定量准确、 多色荧光成像、背景低、灵敏度高、可直接检测、应用范围广等多种优势，其不仅可以进行孔板的In-Cell WesternTM检测，还可以实现近红外荧光定量Western Blot、可见荧光Western Blot 、组织切片成像、On-Cell Western、EMSA/凝胶迁移实验、荧光蛋白质芯片、荧光核酸芯片、考染胶成像、器官成像等多种应用。

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