抗性基因定位难？快来看HiFi测序如何实现精准定位白粉病广谱抗性基因

研究人员通过图位克隆、PacBio HiFi基因组测序、诱变和转化相结合，从野生二粒小麦(WEW)中分离出编码跨膜结构域串联激酶(WTK7-TM)的广谱白粉病抗性基因Pm36。

小麦白粉病

小麦白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麦专化型（Blumeria graminis f. sp. Tritici, Bgt）引起的流行性真菌病害，是过去几十年来造成粮食产量和质量急剧下降的最具破坏性的疾病之一。通过传统育种策略提高作物对病原体的抗性是对抗疾病和减少损失的有效手段。然而，育种的长期性和病原菌变异的快速性使得抗性育种像一场旷日持久的追逐战。因此寻找和挖掘广谱和持久的抗病基因是加速抗性育种的有效策略。

迄今为止，大量研究已在小麦及其野生近缘种中发现数十种白粉病抗性基因(Pm)，但由于小麦基因组庞大且复杂，不仅测序难度大，而且能成功被克隆的Pm基因也是少之又少。在此，研究人员发表在《Nature Communications》的“A membrane associated tandem kinase from wild emmer wheat confers broad-spectrum resistance to powdery mildew”研究报道了通过图位克隆、PacBio HiFi基因组测序、诱变和转化相结合，从野生二粒小麦(WEW)中分离出编码跨膜结构域串联激酶(WTK7-TM)的广谱白粉病抗性基因Pm36。不仅提供了一个在小麦育种中具有巨大潜力的抗白粉病基因，而且揭示了广谱抗白粉病的机制。

结果与讨论

Ml3D232/Pm36的定位及抗性来源分析

WEW六倍体小麦渐渗系3D232在幼苗期对104个不同的Bgt分离株表现出广谱抗性，包括最普遍的E09, E20分离株。3D232中的抗白粉病基因Ml3D232先前已被鉴定并定位在染色体臂5BL31上。通过对高易感小麦普通品系“薛早”与抗性渐渗透系3D232杂交的15893个F2单株进行比较遗传连锁作图，研究人员发现Ml3D232的作图区间(对应于WGGBM2至WGGBM7的区间)与来自WEW的Pm36重叠，表明它们可能是同一基因或等位基因。

为了分离基因座Ml3D232/Pm36的抗性来源基因，研究人员通过PacBio HiFi测序对携带Pm36的WEW四倍体硬粒小麦渐渗系5BIL-29进行测序，生成了四倍体小麦基因组约19.4×覆盖率的PacBio CCS (HiFi) reads。加入约117.3×的Hi-C reads组装后得到2,207个contigs，其中N50为20.8 Mb, N90为4.5 Mb，最长的contigs长度为168.3 Mb，基因组组装总长度为10.5 Gb，覆盖了野生二粒小麦Zavitan (WEW_v1.0)和硬粒小麦Svevo的全基因组。

通过将Pm36位点周围的侧翼和共分离标记WGGBM2与WGGBM7对齐，定位到7.1 Mb contig ptg000422，捕获了跨越整个Pm36的物理定位区间(1.17 Mb)(图1d)。这1.17 Mb的区间内包含11个注释基因：CYB561-Domon, 6个F-box蛋白(F-box 13)， 5个Serpin蛋白(Serpin 1-5)，C端有单个跨膜结构域的串联激酶蛋白(WTK7-TM)和TM9SF4(图1d)。与Zavitan和其他可用的小麦参考基因组相比，渐渗系5BIL-29在Pm36物理定位区域包含约900 kb的插入，包含两个片段重复，包含7个预测基因(图1c, d)。含有一个F-box和两个Serpin基因的约70 kb片段可能被重复了两次。第一个复制额外插入了22 kb，得到92 kb的序列。第二个重复是包含F-box，一个Serpin, 70 kb的转座元件以及WTK7-TM的300 kb序列。这表明基于PacBio HiFi测序对小麦基因组的全覆盖，使得Pm36位点周围的序列得以完整解析。

RNA-seq分析显示，接种Bgt分离株E09后，5BIL-29幼苗叶片1.17 Mb基因组间隔的11个注释基因中，只有CYB561-Domon、TM9SF4和WTK7TM表达。考虑到CYB561-Domon和TM9SF4在之前的转基因实验中被排除，WTK7-TM最有可能是Ml3D232/Pm36抗性来源的候选基因。因此，从5BIL-29和3D232中克隆了10,741 bp的WTK7-TM基因组DNA片段，包括3,277 bp的编码区、3,311 bp的启动子区和4,153 bp的终止子序列(二者序列上一致)。WTK7-TM基因有12个外显子，编码667个残基串联激酶蛋白，包括激酶I (Kin I)和激酶II (Kin II)结构域，以及c端预测的单个跨膜结构域(图1e)。

图1. Ml3D232的图位克隆和Pm36基因的测序分析。

通过VIGS、EMS突变体和转基因实验验证WTK7-TM

为了研究WTK7-TM是否与3D232和5BIL-29中Ml3D232/Pm36的白粉病抗性有关，研究人员分别针对WTK7-TM的Kin I和Kin II结构域进行了病毒诱导基因沉默(VIGS)实验。在BSMV:WTK7-TMKin I和BSMV:WTK7-TMKin II感染植株中，与BSMV:00感染植株相比，3D232和5BIL-29细胞系中WTK7-TM的转录水平均被显著下调(图2a)，3D232和5BIL-29都失去了对Bgt分离株E09的抗性(图2b)。结果表明，WTK7-TM对3D232和5BIL-29抗Bgt是必需的。

3D232经甲烷硫醚(EMS)诱变后，得到的对Bgt分离株E09高度敏感株系(M1-M17, 图2c)在WTK7-TM的Kin I、Kin II和TM结构域出现突变(图2d)，表明其是抗Bgt所必需的。

通过对WTK7-TM农杆菌转化后的获得的转基因的Bgt分离株E09的抗性分析也表明WTK7-TM是Ml3D232/Pm36基因(图3)。

图2. 利用VIGS和甲烷磺酸乙酯(EMS)突变体实验验证WTK7-TM的功能。

图3. WTK7-TM转基因验证。

WTK7-TM的亚细胞定位、结构和催化活性

TKPs是作物抗病的关键调控因子，特别是在小麦和大麦中。但WTK7-TM区别于已知的其他TKPs，其包含膜靶向基序，表明该蛋白可能具有不同的耐药机制。

接着，科研人员对其定位结构进行分析，WTK7-TM蛋白定位于烟草(N. benthamiana)质膜中。在系统发育上WTK7-TM的两个激酶结构域与Rpg1、WTK4和WTK6-vWA位于同一分支，均起源于激酶结构域重复(图4)。分析结构表明Kin I和Kin II结构域是具有潜在催化活性的丝氨酸/苏氨酸(S/T)非精氨酸天冬氨酸(non-RD)激酶，而两个激酶结构域更可能是假激酶，因为丢失了一些保守残基。WTK7-TM蛋白三维(3D)模型进一步揭示了Kin I和Kin II结构域，以及c端单个跨膜结构域(图5a)。最后通过体外磷酸化实验探索WTK7-TM如何发挥其激酶活性：发现全长WTK7-TM (1-667 aa)、Kin I (1-320 aa)或Kin II (321-646 aa)结构域单独不表现出任何自磷酸化或催化活性，而由Kin I + Kin II组成的截短版WTK7-TMKin I-Kin II (1-646 aa)不具有跨膜结构域，却表现出催化活性(图5b、c)。

图4. 预测串联激酶的系统发育分析。

图5 . WTK7-TM蛋白结构预测及激酶活性。

WTK7-TM的地理分布

为了评估WTK7-TM在野生和栽培小麦中的分布，研究人员开发了WTK7-TM-FM特异功能标记，并对WTK7-TM在全球不同地理位置的小麦种质进行了筛选，包括WEW(442份)、栽培二粒小麦(125份)、硬粒小麦(230份)和六倍体小麦(1292份)，它们均对Bgt分离株E09和E20具有抗性，并具有相同的基因组序列和WTK7-TM的CDS。而在其他WEW品系以及驯化的二粒小麦、粗粒小麦和普通小麦中缺失WTK7-TM，表明WTK7-TM可能是一个具有单一古老起源的孤儿基因，并将对当前的小麦基因库产生深远的贡献。

讨论

了解支撑表型变异的遗传变异是克隆作物重要农学基因的必要条件。基因组结构变异(SVs)，包括大缺失、插入、重复和染色体重排，在作物基因组中很常见。尽管多种小麦基因组序列和丰富的变异已经可用，但在特定位点克隆农学上重要的基因，包括抗病基因，仍然是一项具有挑战性的任务。

研究人员使用PacBio HiFi测序方法对携带Pm36的四倍体WEW-硬粒小麦渐渗系5BIL-29进行测序。序列组装后，研究人员发现Pm36位点插入了约900 kb，与Zavitan和其他可用的小麦参考基因组相比，含有额外的7个注释基因，包括WTK7-TM，其中两个片段重复。这一发现还表明，由于参考和泛基因组序列的可用性有限，结构变异是复杂基因组(如小麦及其野生近缘种)基因鉴定的主要障碍。携带单一种特异性Pm基因的抗Bgt小麦品种由于强大的病原体选择压力而容易失去抗性。因此，组合多种多样的抗病基因是小麦病害管理的可持续途径。研究人员挖掘的Pm36基因为今后设计具有广谱抗白粉病的小麦提供了有效策略。

参考文献：Li, M., Zhang, H., Xiao, H. et al. A membrane associated tandem kinase from wild emmer wheat confers broad-spectrum resistance to powdery mildew. Nat Commun 15, 3124 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-47497-w

关于我们

基因有限公司作为PacBio公司的中国区合作伙伴，自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内，一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训，技术支持，应用培训与售后维护工作，赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

关于基因

基因有限公司成立于1992年，是一家提供生命科学科研仪器、试剂耗材和技术服务的综合服务商。基于“Gene Brightens Every Life • BioTech Connects the World”——“基因燃亮生命 • 生物技术连接世界”的愿景，专注于生命科学领域前沿技术的引进和推广，致力于推动该领域国内科研机构硬件水平及实验方案的革新与升级。同时，公司也一直致力于自主品牌的科研设备的研发与生产，拥有一系列通用性强、互补性高的自主品牌产品。

基因的服务网络遍及全国各地十多个大中城市，拥有包括仪器销售，试剂销售，市场与技术支持，维修，客服，物流等多个部门组成的完整服务体系。

我们希望通过不懈努力，为您的成功铺路搭桥，也为中国的生命科学事业赶超世界先进水平尽一己之力。欲了解更多信息，请访问www.genecompany.cn。