猜您喜欢：可信赖的抗体发现平台

在当前的研究中，研究人员旨在模拟AbD工作流程的真实场景，在大量其他抗体分泌细胞中发现分泌目标抗体的单细胞小亚群。然后使用Cyto-Mine®评估了其在亚克隆中的应用，富集小群抗原特异性细胞。

高效快速自动化的抗体发现(AbD)平台

发现和开发能够通过不同分子机制对抗多种疾病的抗体是药物发现的关键领域，并且发展迅速，可提供有效而精确的治疗和诊断解决方案。尽管在检测和分离所需靶标方面已有许多方法，但该领域仍面临着相当大的挑战。因此，专注于检测和分离稀有单细胞的方法和工具不断发展，以提供应对这一挑战的最佳解决方案。

在当前的研究中，研究人员旨在模拟AbD工作流程的真实场景，在大量其他抗体分泌细胞中发现分泌目标抗体的单细胞小亚群。然后使用Cyto-Mine®(第一个基于微滴技术的全自动集成平台)评估了其在亚克隆中的应用，富集小群抗原特异性细胞，从而展示其在所有类型的AbD工作流程中的应用。

方法

①Ag特异性荧光共振能量转移(FRET)测定

用于针对单一抗原(抗TNFα)分泌抗体的细胞的特异性和敏感性检测。该方法通过FRET直接评估抗体分泌情况，其中FRET供体(AF488标记的TNFα)与FRET受体(AF594标记的抗小鼠IgG)配对。这两种FRET探针仅在抗TNFα特异性小鼠IgG存在时结合并形成三分子复合物，在单细胞水平上提供敏感和高度特异性的分泌物检测。

② Spike-in实验

旨在模拟AbD流程的实验，评估Cyto-Mine®检测稀有细胞群的敏感性。在这组实验中，研究人员使用少量分泌抗TNFα特异性抗体的细胞(靶细胞系)与大量其他不相关杂交瘤(分泌水平相似的不同小鼠IgG)对照细胞系混合。

结果与讨论

检测稀有的单细胞分泌群

首先，研究人员评估了两种杂交瘤细胞系(抗TNFα分泌靶细胞和对照细胞)的分泌率，并根据FRET阳性信号和输入的细胞数量判断两者具有相似的IgG分泌细胞比例(图1A;对照杂交瘤40%，抗TNFα分泌杂交瘤38%)。接下来，用CellTracker Deep Red对靶细胞进行荧光标记，将标记的分泌靶细胞(10000,3000,1000,500和200)与1×106个对照细胞按数量递减混合。使用荧光显微镜检测成功标记的靶细胞群(图1B左，未混合)和与对照未标记细胞混合的靶细胞群(图1B右)。相应地，使用Ag特异性FRET试验在Cyto-Mine®上检测到的分泌靶细胞数量随着混入靶细胞数目减少而减少(图1C)。随后在Cyto-Mine®平台上选中这些罕见的细胞并分配到96孔板中，分配过程中会进行单个液滴成像(5个不同位置不同时间)以表明基于Ag特异性FRET信号成功分离了罕见的分泌细胞，并且每个液滴都包裹了一个单细胞(图1D)。

图1-1. Cyto-Mine®检测和分离稀有分泌细胞。

同时，也对分配到孔板中的细胞进行成像，确定在分配板中是否存在CellTracker标记细胞(图1E)。统计分析显示分选分配准确度非常高(95-100%)，证明Cyto-Mine®和FRET测定是检测、选择和分离AbD靶点的可靠和选择性工具。并且在分配过程中使用Cyto-Mine®提供的图像，可以识别不包含单细胞的孔(如图1D中的例2)，从而确保在需要时不选择多克隆孔进行下游处理。

图1-2. Cyto-Mine®检测和分离稀有分泌细胞。

稀有克隆的富集

除了在模拟的原代细胞上进行稀有抗体分泌细胞的检测、分选和分配，Cyto-mine也能胜任的bD工作流程可能涉及永生化B细胞的产生(骨髓瘤-B细胞融合)、分选和分配，分离的单细胞可进行亚克隆分析和高性能克隆的继续生长。

为此，研究人员使用了一种抗体分泌细胞率低的杂交瘤细胞系(4.14%，图2a)。Cyto-Mine®结合Ag特异性FRET测定用于检测和分离含有FRET阳性细胞的液滴。以FRET阴性群体(表示细胞不分泌Ag特异性抗体或空液滴)作为对照，散点图和平板图显示只有FRET阳性的液滴含有细胞(图2B)，证明了FRET试验的特异性。然后，将分配的细胞培养两周，有46.25%的单细胞均可正常生长(图2C)。

图2-1. Cyto-mine筛选分离杂交瘤细胞系的高产克隆。

选择24个克隆继续培养，对前12个克隆进行进一步放大，并使用微孔板读板机进行FRET滴度测定。图2D显示了所选克隆的FRET信号值，其中红框突出显示了最高产量的克隆。使用Cyto-Mine®进一步验证了最高产量克隆8的培养富集，表明筛选高产克隆方法使细胞群阳性率增加了13倍(图2E，从4.14%增加到55.8%)，从而强调了Cyto-Mine®在基于杂交瘤的AbD应用中的相关性和特异性。

图2-2. Cyto-mine筛选分离杂交瘤细胞系的高产克隆。

划重点

英国Sphere Fluidics公司的Cyto-Mine微流控单细胞分析筛选平台可胜任AbD工作流程：

 功能多样化：①可在1天内筛选得到特异性抗体分泌的浆细胞；②共包裹两种或以上的细胞基于细胞结合进行表达特异性重组蛋白抗体的细胞分选；③共包裹两种或以上的细胞基于TCR细胞活化进行功能性浆细胞或杂交瘤细胞的筛选。

 自动化：整个实验流程自动化、标准化，分配至微孔板中的目的细胞可直接进行单细胞PCR、单细胞测序等进行抗体基因recovery、重组质粒表达以及特异性、亲和力以及功能性的测试。

 快速：所有的工作最快在4周左右的时间即可完成。改善了抗体发现的实验流程，大大加快了抗体发现的步伐。

基因有限公司是英国Sphere Fluidics在中国区域推广和销售的合作伙伴，在全国17个城市均有驻当地的办事处。可为您提供售前产品咨询与技术交流、售后安装、应用培训等优质服务。如果想了解更多关于Cyto-Mine的介绍，欢迎点击下方往期合集进行参阅。或者您也可以直接添加下方产品经理企业微信进行一对一沟通。

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