使用DS3000 Compact CE Sequencer提高短DNA读取精度

概要

在Sanger测序中，时有在开始读取的区域中无法获得峰波形，或者出现读取错误的情况。这是由于填充在毛细管中的电泳介质 (聚合物) 有无法正确检测，分离短DNA的情况。

此实验是使用DS3000 Compact CE Sequencer，提高了开始读取区域的数据质量[1] 的示例。与以往不同之处在于使用了加尾引物，测序引物5’末端加入任意碱基序列延长反应产物。用处在于当添加40个碱基至尾部时，可从测序引物的3’末端下游第1个碱基的DNA开始无错误地读取。

另一方面，由于尾部碱基的添加，碱基有效读取的长度也相应缩短。因此在添加尾部碱基时，请参考本报告，事先确认分析区间。

结果

对质粒DNA进行测序

使用T3引物对质粒DNA(pTS1) 进行了测序。测序引物尾部添加了40个碱基。

首先，通过峰波形确认了加尾引物的效果(图1，请注意图中的碱基长度是以引物的3’末端为0计数的)。在没有尾部引物的测序结果中，无法确认从引物的3’末端到第17个碱基的峰波形。第20个碱基以后可以确认明确的峰波形，但仍发生了读取错误(图1A红框部分)。相反，在加尾引物的测序结果中，可以确认到从引物的3’末端开始的第1个碱基的峰波形。并且，在图中的范围内未发生读取错误。

图1. 峰波形比较。显示了使用无尾引物(A)与加尾引物(B)得到的峰波形。碱基长度是将引物的3’末端为0来计数。请注意与普通的测序查看器不同。红色阴影处表示获得与正确序列不同结果的部分。使用Std-seq实施测序方式。

碱基识别起始位置的比较

其次，比较了碱基识别的起始位置(图2)。DS3000有2种测序模式。通常，Fast sequencing (Fast-seq) 适用于在短时间内得到尽可能长的读取长度，而Standard sequencing(Std-seq)适用于需得到比Fast-seq更长的读取长度的情况。

在本实验中，分别使用两种测定模式进行了验证。结果显示无论使用哪种测定模式，均可通过添加尾部，获得准确的碱基识别的峰波图。特别是在使用Std-seq的情况下，16次实验均从第1个碱基开始准确地进行碱基识别。

图2. 碱基识别起始位置的比较。显示了以测序引物的3’末端为起始，计数从第几个碱基开始DS3000开始了准确的碱基识别。在每个条件下进行了16次实验。柱状图表示平均值，bar表示标准偏差。在Std-seq中，因为有加尾引物的存在，所有实验均从样本第1个碱基开始碱基识别，所以没有bar。

序列读取精度的比较

最后，比较了准确读取结束的位置。图3显示了识别出碱基的准确性保持在99%以上的最后一个碱基的位置。在两种测定模式中，加尾均缩短了读取结束位置(图3)。 

作为电泳的特性，DNA越长，分离性能越低，更难正确识别碱基。加尾引物添加得到碱基使得样本碱基起始得以准确识别，同时占用了一定的读取长度，因此长碱基的分离性能将降低，准确读取结束位置相比无加尾引物会提前。

图3. 读取碱基结束位置的比较。显示了在各条件下获得的读取结束位置。读取结束位置显示了识别的准确性维持在≥99%的最后的碱基的位置。以测序引物的3’末端为0来计数。柱状图为16次实验获得的平均值，bar表示标准偏差。使用威尔科克森检验计算p值。

结论

将40个碱基添加到测序引物尾部，可改善开始读取区域的读取错误与碱基识别的起始位置。特别是在使用Std-seq的验证时，在所有实验中，从引物的3’末端下游的第1个碱基开始获得清晰的波形数据与准确的碱基识别。另一方面，当添加尾部时，读取的碱基长度将相应变小。在添加尾部时，请参考本报告，事先确认分析区间。

注意事项

当测序引物的尾部与模板DNA退火时，测序数据中会出现噪音并降低准确性。使用软件设计尾部的碱基序列时，应尽量避免其与模板DNA发生配对，要特别注意尾部与模板DNA退火区域的Tm值，应不超过引物的Tm值。避免引物二聚体或发夹结构[2]，且尾部不宜太长，建议一般≤40个碱基。

实验方法

将pTS1作为模板进行循环测序(表1~3)。反应产物通过乙醇沉淀纯化，并溶解在10 μL HiDi formamide (Thermo Fisher Scientific)中。使用DS3000进行测序分析(表4)。峰波形是基于sangerseqR3绘制的。

参考文献

1.Binladen, J., et al. 5'-Tailed sequencing primers improve sequencing quality of PCR products. BioTechniques. 42 (2), 174-176 (2007)

2.Untergasser, A., et al. Primer3̶new capabilities and interfaces. Nucleic Acis Research. 40 (15), e115 (2012)　https://www.primer3plus.com/ 

3.Hill, J., T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243, 1632-1636 (2014)

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