靶向难成药靶点E3连接酶的降解剂

　　

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清华大学药学院饶燏团队与合作者开发：靶向难成药靶点E3连接酶的降解剂

01｜研究背景

PROTAC（PROteolysis TArgeting Chimera）是一种通过双功能小分子诱导目标蛋白泛素化并实现目标蛋白降解的的新型蛋白降解技术。此技术已成功实现多种药物靶点的降解，包括激酶、受体等，也已广泛应用于多种疾病的治疗，包括肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病和神经退行性疾病等。PROTAC事件驱动的作用模式使其对目标蛋白的亲和力要求降低，理论上可以实现缺乏有效配体的难成药靶点降解剂开发。但遗憾的是，目前针对难成药靶点降解剂的开发仍然较少。

E3连接酶是细胞内催化蛋白质泛素化修饰的关键蛋白，在细胞生理和病理过程中具有广泛而重要的功能，其异常表达或功能失调与多种疾病（包括癌症、神经退行性疾病和免疫疾病）。但由于E3连接酶有六百多种，每种酶都有其特定的底物，这种多样性使得开发能够特异性靶向单一E3连接酶的药物变得非常困难。同时E3连接酶结构复杂，包含多个结构域和亚基，且这些结构域在蛋白-蛋白相互作用中起关键作用，传统小分子抑制剂难以同时靶向所有结构域和亚基，不能完全阻断E3连接酶的功能。最后，由于E3连接酶的活性位点往往较宽且与底物结合较松散，因此难以用传统小分子药物实现E3连接酶的功能扰动。因此，E3连接酶作为一类难成药靶点，需要新的开发技术和策略实现其药物开发。

Smurf1（Smad ubiquitination regulatory factor 1）是一种HECT（Homologous to the E6AP Carboxyl Terminus）型E3泛素连接酶，参与多种生理过程，如1）通过与Smad蛋白相互作用，促进Smad1和Smad5等Smad蛋白的泛素化和降解，负反馈调控TGF-β信号通路的活性；2）通过降解某些细胞周期调控蛋白，如RhoA，参与细胞周期的调控，影响细胞增殖；3）通过泛素化降解Runx2（骨形成关键转录因子）或者调控BMP（骨形态发生蛋白）信号通路，影响骨形成和重塑。Smurf1已成为药物开发的潜在靶点，但E3泛素连接酶作为一种代表性的难成药靶点，开发针对Smurf1的选择性小分子抑制剂一直充满挑战。

02｜研究成果

       

2024年7月22日，清华大学药学院饶燏团队与国家蛋白质科学中心（北京）张令强、崔春萍及南方医科大学Zhang Xueli 团队合作在《Nature Chemical Biology》上发表了题为“Targeting Smurf1 to block PDK1–Akt signaling in KRAS-mutated colorectal cancer”的研究文章。在这项研究中，作者揭示了Smurf1介导的磷酸肌苷依赖性蛋白激酶1(PDK1)类化修饰在PI3K-Akt信号传导和肿瘤发生中的重要作用，并利用新的PROTAC开发策略获得了具有独特配体的高效Smurf1的降解剂。这种开发策略为难成药靶点的降解剂开发提供了创新思路。

       

03｜研究内容

首先，作者发现在生长因子刺激下，Smurf1立即触发PDK1类化修饰，多神经前细胞表达发育下调的蛋白8 (poly-Nedd8)链募集甲基转移酶SET结构域分叉组蛋白lysine甲基转移酶1(SETDB1)。PDK1胞质复合体与Smurf1和SETDB1组装(cCOMPASS)，由PDK1、Smurf1和SETDB1组成，指导Akt膜附着和T308磷酸化。在遗传小鼠模型中，Smurf1缺陷显著降低CRC肿瘤发生。

随后，作者利用药物发现中的优势结构和生物活性片段作为基本单元，通过不同类型的连接链和E3泛素连接酶配体，构建了一个结构多样性的PROTAC库。这种策略极大地扩展了化合物在化学空间中的分布。利用HiBiT高通量筛选技术，快速获得Smurf1苗头降解剂。经过多轮筛选和结构优化（从大规模到小规模库），最终开发出了具有独特配体的高效Smurf1降解剂SMART1，成功克服了这一难成药靶点的挑战（图1a）。

图1. Smurf1降解剂分子SMART1 的开发及评价

实验结果表明，SMART1能够与Smurf1的HECT域结合（KD = 500 nM），而不与Smurf2结合（图2a-d）。在HCT116细胞中，SMART1可以依时间和剂量递增的方式诱导Smurf1降解（DC50 = 1~5 nM，Dmax为86%）（图1b）。当存在CRBN或Smurf1配体时，SMART1诱导的Smurf1降解会受到阻碍（图2g），这表明SMART1通过与Smurf1和CRBN结合来实现其降解作用。生物发光共振能量转移和共免疫沉淀实验也显示SMART1能有效与Smurf1和CRBN形成三元复合物，且在高达10μM时，PROTAC降解剂的“Hook效应”并不明显（图1c，2h）。与野生型Smurf1相比，Smurf1的Y439A突变体与SMART1之间的相互作用显著减弱，并且SMART1无法有效降解该突变体；同时，CRBN的缺失削弱了SMART1的作用（图2i-k）。预处理蛋白酶体抑制剂MG132或Nedd8 E1抑制剂MLN4924可以阻断Smurf1的降解。不同于泊马度胺或Smurf1配体，SMART1增加了细胞中Smurf1的泛素化，表明其作用依赖于蛋白酶体机制和cullin–RING泛素化级联（图2l）。定量蛋白质组学分析进一步证实了Smurf1的显著下调，彰显了SMART1的高选择性（图1d）。在小鼠异种移植瘤模型中，SMART1显示出强大的体内肿瘤抑制效果，同时具有较低的毒性，表现为动物体重无显著变化，重要器官的组织病理学检查未发现异常（图1e-1h）。此外，作者分析了其他含HECT结构域的连接酶、U3 snoRNA结合蛋白（U3 snoRNA结合蛋白RRP9是唯一已知的由Smurf1催化的Nedd8底物）或已报道的CRBN配体的脱靶蛋白在丰度上均未有显著变化（图2m, n）。这些数据均表明，SMART1是一种高效、高选择性的新型Smurf1蛋白降解剂。

图2. SMART1通过直接结合Smurf1诱导其依赖于泛素-蛋白酶体系统的选择性降解。

       

       

04｜研究结论

综上，本研究通过揭示类泛素化修饰在PDK1激活中的未被探索的作用，阐明了E3连接酶 Smurf1是KRAS突变型结直肠癌的药物靶标。针对难成药靶点Smurf1，本研究基于成药片段结构和生物活性片段，构建了覆盖广泛化学空间的降解剂库；通过应用HiBiT高通量筛选，快速成功开发了一种具有独特创新靶蛋白配体的降解剂，降解剂在体内外表现出强大的肿瘤抑制作用，在免疫能力强的小鼠中耐受性良好。这种高效且高选择性的Smurf1蛋白降解剂为KRAS突变的结直肠癌治疗提供了潜在的治疗药物和策略，同时为难成药靶点的降解剂开发提供了新思路。

饶燏团队长期从事蛋白质靶向降解技术的开发工作，致力于发展新型降解技术及其应用，已取得了一系列研究成果：发展基于降解的蛋白质分析（Degradation-Based Protein Profiling，DBPP），并将其应用于中药活性成分的靶点鉴定（Advanced Science 2024）；将PROTAC首次应用于相分离，建立了基于PROTAC的BRD4相分离研究新方法（Cell Discovery 2023）；提出了 PROTAC 和分子胶协同应用的模式，首次设计合成了新型双靶、双机制的降解剂，为靶向降解技术的发展提出了新的思路（Cell Research 2021）；实现难成药靶点的药物开发，设计合成全球首例选择性CDK2降解剂，实现AML高效且低毒的分化治疗（Nature Chemical Biology 2021）；构建高效的BTK降解剂，解决临床中出现的Ibrutinib耐药问题（Cell Research 2018；Leukemia 2019）;构建PROTAC系统性敲除模型，快速可逆实现动物体内蛋白敲除（Cell Discovery 2019）；构建新型CDK4/6降解剂，有效抑制肿瘤增殖（Journal of Medicinal Chemistry 2019）。此次研究也是该团队拓展PROTAC在难成药靶点方面的应用。

清华大学药学院饶燏课题组已毕业博士生贺明为该论文共同第一作者，清华大学饶燏教授为论文共同通讯作者。本研究由国家重点研发计划和中国国家自然科学基金共同资助。

           

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01683-5