单细胞成像拓展：如何避免细胞损伤

科学家们使用一种结合硬X射线计算机断层扫描和X射线荧光成像的多模态方法来观察单个细胞内部的结构和化学过程。

　　

每一种植物、动物和人都是由微小的特化细胞组成的丰富的缩影。这些细胞都是自己的世界，每个细胞都有自己独特的部分和过程，无法用肉眼看到。能够在纳米分辨率下看到这些微观构建块的内部运作而不损害其精致的细胞器一直是一个挑战，但来自美国能源部(DOE)布鲁克海文国家实验室不同学科的科学家已经找到了一种使用多种技术对单个细胞成像的有效方法。捕捉这些图像的迷人过程发表在《Communications Biology》上。

能够理解细胞的内部结构，化学物质和蛋白质在细胞内相互作用的方式，以及这些相互作用如何在纳米分辨率下指示某些生物过程，对医学、农业和许多其他重要领域都有重大意义。这项工作也为更好的生物成像技术和优化生物成像的新仪器铺平了道路。

“研究人类细胞及其内部的细胞器是令人兴奋的，”布鲁克海文实验室的结构生物学家Qun Liu说，“但我们的多模态方法结合了硬X射线计算机断层扫描和X射线荧光成像，有很多机会从中受益。”我们可以研究致病真菌或有益细菌。我们不仅能看到这些微生物的结构，还能看到细胞以不同方式相互作用时发生的化学过程。”

拔出生命的一个组成部分

在研究人员开始成像之前，他们面临的最大挑战之一是准备样本本身。研究小组决定使用来自人类胚胎肾(HEK) 293系的细胞。众所周知，这些细胞很容易生长，但很难进行多次X射线测量。尽管细胞很小，但它们很容易受到X射线引起的损伤。

科学家们经历了一个小心的、多步骤的过程，以使样本更坚固。他们使用多聚甲醛来化学保存细胞的结构，然后让机器人将样品放入液态乙烷中快速冷冻，然后将它们转移到液氮中，最后冷冻干燥，以去除水分，但保持细胞结构。一旦这个过程完成，研究人员将冷冻干燥的细胞放在显微镜下定位和标记，以便进行目标成像。

由于直径只有12-15微米(人类头发的平均厚度为150微米)，设置样品进行测量并不容易，尤其是在不同的光束线上进行测量。该团队需要确保电池的结构能够经受住高能X射线的多次测量而不会受到重大损害，并且电池可以可靠地固定在一个地方进行多次测量。为了克服这些障碍，科学家们创造了标准化的样品支架，用于多个设备，并实施了光学显微镜，以快速找到和成像细胞，并最大限度地减少长时间的X射线暴露，可能会损害它。

多通道测量

该团队使用了在布鲁克海文的美国能源部科学办公室用户设施国家同步加速器光源II (NSLS-II)中发现的两种成像技术——X射线计算机断层扫描(XCT)和x射线荧光(XRF)显微镜。

研究人员在全场X射线成像(FXI)光束线上收集了XCT数据，该数据使用x射线告诉科学家细胞的物理结构。断层扫描使用x射线来显示固体样品的横截面。一个熟悉的例子是CT扫描，医生用它来成像身体任何部位的横截面。

研究人员在亚微米分辨率X射线光谱(SRX)光束线上收集了XRF显微镜数据，这些数据提供了更多关于细胞内化学元素分布的线索。在这项技术中，研究人员将高能X射线对准样品，激发材料并使其发出X射线荧光。X射线发射有其独特的特征，让科学家确切地知道样品是由什么元素组成的，以及它们是如何分布以实现其生物功能的。

FXI首席光束线科学家Xianghui Xiao表示:“基于各自提供的独特、互补的信息，我们有动力将XCT和XRF成像结合起来。荧光为我们提供了许多关于细胞内微量元素及其分布的有用信息。这对生物学家来说是非常重要的信息。然而，在许多细胞上获得高分辨率荧光图可能非常耗时。即使只是一张2D图像，也可能需要几个小时。”

这就是使用XCT获得细胞的3D图像的地方。这些信息可以帮助引导荧光测量到感兴趣的特定位置。它为科学家节省了时间，增加了通量，还确保了样品不需要长时间暴露在X射线下，减轻了对脆弱细胞的潜在损害。

SRX的光束线科学家Yang Yang说:“这种相关的方法提供了有用的、互补的信息，可以推进几种实际应用。对于像药物输送这样的事情，可以识别特定的细胞器亚群，然后可以追踪特定的元素，因为它们在治疗过程中被重新分配，让我们更清楚地了解这些药物是如何在细胞水平上起作用的。”

虽然这些成像技术的进步为细胞世界提供了更好的视角，但仍有挑战需要应对，也有进一步改进成像技术的方法。作为NSLS-II实验工具III项目的一部分，该项目计划建立新的光束线，为用户社区提供新的功能。Yang是即将到来的定量细胞断层扫描(QCT)光束线的科学领导，该团队将致力于生物成像。QCT是一种全方位软X射线断层成像光束线，用于成像纳米级分辨率的冷冻细胞，无需化学固定。这种低温软X射线断层扫描光束线将是现有方法的补充，提供更多关于细胞结构和功能的细节。

未来的发现

虽然能够窥视构成人体系统的细胞是令人着迷的，但能够了解攻击和破坏这些系统的病原体可以让科学家在对抗传染病方面具有优势。

“这项技术使我们能够研究病原体与其宿主之间的相互作用，”Liu解释说。“我们可以在感染前观察病原体和健康细胞，然后在感染期间和感染后对它们进行成像。我们将注意到病原体和宿主的结构变化，并对这一过程有更好的了解。我们还可以研究人类微生物组中有益细菌或与植物有共生关系的真菌之间的相互作用。”

Liu目前正在与其他国家实验室和大学的科学家合作，为美国能源部的生物和环境研究计划研究高粱与炭疽菌之间的分子相互作用，炭疽菌是一种引起炭疽病的致病真菌，可以损害植物的叶子。高粱是美国能源部的主要生物能源作物，也是世界上第五大谷类作物，因此，通过了解这种破坏性真菌的策略以及高粱在细胞和分子水平上的防御机制，人类将受益匪浅。

能够看到这种规模可以让科学家深入了解病原体对作物、环境甚至人体发动的战争。这些信息可以帮助开发正确的工具来对抗这些入侵者，或者修复在基础层面上不能最佳工作的系统。第一步是能够看到人眼无法看到的世界，同步加速器科学的进步已被证明是揭示这一点的有力工具。

Correlative single-cell hard X-ray computed tomography and X-ray fluorescence imaging