CRISPR技术新成员：教基因剪刀检测RNA

CRISPR-Cas系统，细菌中的防御系统，已经成为分子诊断技术的丰富来源。位于德国维尔茨堡的亥姆霍兹研究所(HIRI)的研究人员已经扩展了这个广泛的工具箱。他们的新方法，称为PUMA，可以用Cas12核酸酶检测RNA, Cas12核酸酶天然靶向DNA。PUMA承诺广泛的应用和高精度。研究小组在《自然通讯》杂志上发表了他们的研究结果。

　　

细菌已经发展出特殊的防御机制来保护自己免受病毒的侵害，而病毒绝不仅仅感染人类。作为这些所谓的CRISPR- cas系统的一部分，作为“向导RNA”的CRISPR核糖核酸(crRNA)可以识别外来基因组的区域，例如病毒DNA。crispr相关(Cas)核酸酶在crRNA的指导下，像剪刀一样将其切割成无害的。人类已经利用了这一策略:“CRISPR，通常被称为‘基因剪刀’，是许多分子技术的基础，”Helmholtz RNA感染研究所(HIRI) RNA合成生物学系主任Chase Beisel说。

Beisel实验室与JMU于2021年合作开发的诊断平台LEOPARD也利用了CRISPR技术。LEOPARD有潜力在一次测试中检测各种疾病相关的生物标志物。这种方法是基于对RNA因子进行重编程，即所谓的tracrRNAs。这些rna自然参与帮助产生Cas9和不同Cas12核酸酶使用的引导rna。LEOPARD专注于Cas9。然而，CRISPR-Cas系统还包括另一组不同的核酸酶，称为Cas12，”Beisel解释说。虽然Cas9和Cas12都能切割DNA靶标，但Cas12可以通过切割“附属”DNA来增加输出信号。这可以使检测技术更敏感，从而更有效。

Chase Beisel领导的团队现在已经将LEOPARD的独特功能扩展到了Cas12。研究人员将这种方法命名为PUMA(可编程tracrnas解锁原间隔区邻近基序的Cas12核酸酶独立检测核糖核酸)。他们发现的细节是《自然通讯》杂志上一篇论文的主题。

尽管Cas12核酸酶在分子诊断中得到了广泛的应用，但仍然存在两个主要的限制:基于Cas12的技术仅限于DNA靶标，并且需要一个称为PAM的特定识别序列来识别目标分子。

PUMA优雅地应对了这些挑战。和LEOPARD一样，这种新方法也依赖于tracrrna。“使用PUMA，我们可以重新编程tracrrna。这使我们能够决定哪个RNA生物标记物成为向导RNA。

该研究的第一作者Chunlei Jiao解释说:“这种引导RNA反过来将Cas12引导到我们提供的DNA分子上，并激活基因剪刀。”

Beisel补充说:“DNA切割告诉我们样品中存在哪种生物标志物，例如针对不同病原体的生物标志物。”

因此，这种新方法能够使用通常只能识别DNA的CRISPR核酸酶检测RNA生物标志物。“这对于只能在RNA水平上发现的分子生物标志物尤其重要。例如，这包括RNA病毒，”然而，PUMA不需要特定的识别序列:PAM包含在提供的DNA靶分子中。由于研究人员提供了目标分子，他们也可以引入截短的DNA。因此，他们能够显著提高该方法的速度。

“PUMA有潜力成为一种灵活而精确的RNA检测工具，”Beisel总结道。最后，该团队通过鉴定与急性败血症相关的五种细菌病原体，证明了该方法的潜力。他们的检测依赖于一个单一的通用的、重编程的tracrRNA，它提供了一种区分不同类型细菌的简化方法。这在医学上开辟了广泛的潜在应用:“这项新技术代表了一种新的CRISPR诊断形式，可以在护理点进行可靠的分子检测——无论是病毒或细菌病原体的鉴定，还是癌症生物标志物的检测，”Chunlei Jiao说。

研究小组已经在计划下一步:“我们的目标是实现与LEOPARD类似的多路读出，并扩大该技术的应用范围，”Beisel说，他还预计该技术将在研究界得到广泛应用:“我们希望我们的研究将促进对tracrRNA重编程的进一步探索。”

该研究由欧洲研究委员会(ERC整合者奖给Chase Beisel)和德国联邦教育和研究部(BMBF)的“GO-Bio初始”项目资助。