CasX靶标搜索和切割过程的动态调控机制

　　

CRISPR-Cas系统是细菌和古生菌中对抗外源核酸入侵的获得性免疫系统。基于CRISPR-Cas系统在RNA引导下靶向DNA的功能，已经开发了多种被广泛使用的基因编辑和调控工具。CasX（又称Cas12e）属于第2类CRISPR-Cas系统，因其体积较小，相较于广泛使用的Cas9和Cas12a蛋白更便于递送到细胞内，展现出巨大的应用潜力。 但除了共有的RuvC核酸酶结构域外，CasX与Cas12a和Cas9在蛋白序列上相似性甚微。此外，CasX独有的NTSB结构域，对于其切割活性至关重要。这些不同之处暗示了CasX可能具有独特的靶向和切割机制。

2024年7月12日，清华大学生命科学学院陈春来课题组与刘俊杰课题组合作在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）杂志发表了题目为 “单分子FRET揭示CasX（Cas12e）在DNA切割过程中的构象动态（Conformational dynamics of CasX (Cas12e) in mediating DNA cleavage revealed by single-molecule FRET）” 的研究论文。该论文细致表征了CasX从非特异性结合到找到靶点并完成切割的动态过程，揭示了其独特的机制。

利用供体（Cy3）标记的sgRNA和受体（Cy5）标记的DNA，研究者通过单分子FRET实验捕捉到CasX蛋白在切割过程中依次呈现的3种构象状态：R-loop起始状态、R-loop形成后非靶标链（NTS）切割状态和靶标链（TS）切割状态（图1）。此外，还定量分析了sgRNA与DNA的匹配度如何影响CasX在DNA上的稳定性和切割活性，为基于CasX的基因编辑和调控工具的设计提供了重要依据。DpbCasX和PlmCasX在切割特异性上的差异，源于它们在结合DNA及切割过程中的动力学差异；而两者在切割过程中FRET模式的不同，则归因于它们在DNA上切割位点的差异。

图1. DpbCasX结合及切割全匹配DNA的构象动态。

在本文中，研究者还提出了“有效靶标搜索效率”这一新的概念，用以衡量Cas蛋白在接触靶标后的有效识别效率。数据显示，CasX的有效靶标搜索效率（仅10%）远低于Cas9和Cas12a（50%-80%）。这意味着，CasX需要尝试约10次才能成功识别靶标位点，细胞内复杂环境可能进一步降低其搜索效率，从而导致其在细胞内较低的编辑活性。这一发现为未来优化CasX以及其他Cas蛋白提供了新视角。

最后，研究者构建了CasX识别与切割DNA的动态模型（图2）。CasX在搜寻靶点时与DNA短暂非特异性结合（Nonspecific binding），在动态搜索过程中识别PAM序列（PAM recognition），开始形成R-loop结构（R-loop initiation），然而，相较于SpCas9、AsCas12a和LbCas12a， CasX在这一步的效率低5-8倍。识别PAM后，CasX依赖充足的PAM近端匹配驱动R-loop形成，并利用单一的RuvC结构域活性中心依次切割NTS和TS（R-loop formation and NTS cleavage，TS cleavage），最后释放切割产物（DNA fragment release）。CasX独特的NTSB结构域在DNA解旋和R-loop形成中发挥了重要功能。这一动态模型深化了我们对CasX工作机制的理解，并为CasX以及其他Cas蛋白的优化和改造提出了新的思路和策略。

图2. CasX结合和切割DNA的动态模型。

清华大学生命科学学院陈春来副教授和刘俊杰副教授为本文共同通讯作者；清华大学生命科学学院18级博士生邢文婧和18级博士生李丹苑为本文共同第一作者；生命科学学院高级工程师王文娟博士参与了本项目研究。本工作获得了国家自然科学基金委、国家重点研发计划、中国农业农村部、北京结构生物学高精尖创新中心、北京市生物结构前沿研究中心、清华-北大生命科学联合中心的经费支持。

论文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkae604

课题组相关论文链接：

https://doi.org/10.1039/D1SC02633J

https://doi.org/10.1039/D2SC05463A

https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.08.005

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.048