从原核基因组防御系统中继续淘金：DdmDE消除质粒的分子机制 Ago是下一个CRISPR吗

目前流行的霍乱弧菌菌株有两种基因组防御系统：DdmABC和DdmDE。哥伦比亚大学的研究人员利用低温电子显微镜研究了DdmDE的质粒消除机制，发现DdmE是一种DNA引导的原核生物Argonaute，它招募并激活下游效应蛋白DdmD，其解旋酶和核酸酶活性协同降解质粒DNA。通过揭示抗质粒免疫的分子机制，为DdmDE的生物技术应用奠定基础。

　　

原核生物和侵袭性移动遗传元件(MGEs)之间的进化军备竞赛导致了各种宿主防御系统——如限制性修饰、CRISPR-Cas、Argonaute、CBASS(基于环寡核苷酸的噬菌体信号系统）等等的出现，以抵御侵袭性移动遗传元件(MGEs)的入侵，在消除入侵的MGE和塑造微生物群落和生态系统中发挥关键作用。由于许多分子基因工程工具都起源于原核基因组防御系统，因此了解原核免疫系统不仅对于揭示原核宿主- MGE相互作用的动力学至关重要，而且对于开发应用于生物技术和医学的分子工具也很有价值——看看如今的CRISPR技术就知道。

目前流行的霍乱弧菌菌株含有两个DNA防御模块DdmABC和DdmDE，它们合作消除质粒，被认为在第七次大流行的O1 El Tor (7PET)菌株的进化成功中发挥了关键作用。来自哥伦比亚大学的研究人员使用低温电子显微镜来确定DdmDE防御质粒的机制基础。解旋酶-核酸酶DdmD采用自抑制二聚体结构。原核Argonaute蛋白DdmE使用DNA向导靶向质粒DNA。体内突变研究证实了DdmDE复合物的结构，表明DNA与DdmE的结合会引发DdmD二聚体的分解，并将单体DdmD装载到非靶DNA链上。体外研究表明，DdmD沿5′~ 3′方向易位，同时部分降解质粒DNA。这些发现为了解DdmDE系统在质粒消除中的机制提供了重要的见解。文章发表在新一期《Science》上。

DdmABC是一种类似lamasus的防御系统，被质粒和噬菌体激活时可导致不产生有感染性病毒的顿挫感染（abortive infection）。 相比之下，DdmDE系统直接作用于小质粒，导致其降解。结构模型表明，DdmE是一种可能识别质粒DNA的原核Argonaute (pAgo)蛋白，而DdmD编码一种融合蛋白，该融合蛋白包含可以介导质粒降解的解旋酶和核酸酶结构域。这项研究目标是探究DdmDE系统在质粒消除中的机制，为将来改造为基因工具奠定基础。

结果

DdmE是DNA引导的DNA靶向Ago

pAgo蛋白使用短核酸向导来指导核酸的识别和靶向。作者首先对828个pAgo序列进行了系统发育分析，DdmE的多重序列比对和AlphaFold 2结构建模显示，在其PIWI结构域中缺乏典型的DEDX催化四聚体，表明DdmE蛋白缺乏内切酶活性，并表明与其他长a pAgo蛋白相比，DdmE不通过内切酶催化的靶核酸切割发挥作用。数据表明，DdmE使用短的(<15 nt) 5 '磷酸化DNA作为tDNA结合的向导。

质粒消除需要DdmD的ATP酶和核酸酶活性

结构模型预测DdmD含有N端超家族2 (SF2)解旋酶和c端PD-(D/E)XK核酸酶结构域，这表明DdmD可能作为下游效应物，在被DdmE招募和激活后降解质粒DNA。值得注意的是，单独使用DdmD对ssDNA质粒具有显著的降解活性，而单独使用DdmD未观察到质粒dsDNA的降解，表明DdmD是一种有效的ssDNA核酸酶，需要DdmE激活并招募到其质粒DNA靶点。DdmDE系统的活性包括DNA引导的DdmE靶向和依赖于腺苷三磷酸酶(ATPase)的核酸酶催化的DdmD质粒降解。

DdmD受二聚化作用的自动抑制

为了深入了解解旋酶-核酸酶DdmD在DdmDE体系中的活性机制，作者利用单粒子冷冻电镜(cryo-EM)确定了二聚体DdmD的原子结构，表明DdmD是一种PD-(D/E) xk样核酸酶，其催化活性对于DdmDE防御系统消除质粒至关重要；DdmD以二聚体形式存在于自抑制状态，这与在没有DNA引导的DdmE的情况下，DdmD在体外dsDNA质粒上不表现出核酸酶活性的观察结果一致。

DNA引导的tDNA识别和DdmE招募DdmD

为了深入了解DdmE的分子结构及其在DdmD激活中的作用，作者重组了一个带有14-nt 5 '磷酸化DNA向导的DdmD-DdmE复合物和一个带有错配非靶链的靶dsDNA，以促进d环的形成。DdmDE复合物的结构表明，DdmD同型二聚体在与靶结合的DdmE相互作用时解体，形成1:1的异源二聚体，其中DdmE与gDNA-tDNA双链结合，而DdmD与移位的非靶DNA (ntDNA)链结合。研究还表明tDNA结合的DdmE招募DdmD，DdmD-DdmE相互作用是支持其抗质粒活性所必需的关键分子决定因素。

DdmE介导DdmD装载到ntDNA链上

部分讨论

研究阐明了支持的DdmDE系统的抗质粒活性的分子机制：DdmE属于催化活性不高的长-a- pAgo蛋白的亚支系，它使用5 ' -磷酸化的DNA向导来靶向DNA。解旋酶核酸酶DdmD最初由于自二聚化而处于自抑制状态。tDNA与DdmE的结合将DdmD招募到ntDNA链上，诱导DdmD二聚体的分解。这反过来又启动了DdmD通过ATP驱动的ntDNA降解，在5 '到3 '方向上的过程易位。

DdmDE的机制与I型CRISPR-Cas系统的分子机制有显著的相似之处，在I型CRISPR-Cas系统中，RNA引导的效应复合物Cascade将解旋酶-核酸酶融合蛋白Cas3招募到ntDNA链上。随后，Cascade和Cas3保持在复合物中，而DNA被Cas3的解旋酶结构域反复解旋，在DNA靶标中产生短段的ssDNA。

鉴于I型CRISPR-Cas系统已被重新用作分子靶向技术，新研究表明，DdmDE可能被利用来通过递送DNA来消耗细菌菌株，这些DNA将作为自我靶向向导的来源。基于CRISPR-Cas9的类似方法已用于靶向致病的毒力基因，DdmDE可以用来产生自我消除质粒，用于基于重组的基因组工程方法。新研究为DdmDE系统在原核生物基因组防御中的功能提供了基本的机制见解，并可能为利用它们作为新型抗菌或基因工程工具铺平道路。