Onso短读测序：告别“大海捞针”

Onso测序这些提供为研究人员打开了体验Q40+精度的令人难以置信的准确性的大门，其成本低于性能较差的系统。

　　

十多年来，Q30标准的下一代测序精度一直被认为“足够好”，尽管它存在固有的局限性。Onso短读测序的引入重新定义了这一标准，提供了非常准确的读取，错误率仅为1 / 10,000个碱基或更少(质量分数为Q40+)。

这种非凡的准确性是通过结合(SBB)化学的创新测序实现的，其中包括对传统合成(SBS)化学测序的几个关键增强。高SBB精度提供了优化的测序化学，缺乏分子疤痕，并提供极低的假阳性，从而提高了罕见变异检测的灵敏度。

Onso系统擅长于大海捞针的应用，如液体活检研究。现在，通过三个富有洞察力的案例研究，探索Onso系统的卓越准确性如何扩展到肿瘤学，公共卫生和人类遗传学研究等不同领域。

在公共卫生监测中密切关注更多的细菌种类

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虽然废水监测在2019冠状病毒病大流行期间首次成为头条新闻，但它已成为流行病学和公共卫生的常规和不可或缺的工具。这种进化的部分功劳可以归功于现代文化独立测序。

PacBio和Zymo Research最近合作进行了一项废水监测研究，并在今年的ASM会议上发表。本研究使用Zymo的Quick-DNA/RNA水试剂盒来处理实际废水样品。然后在PacBio Onso系统和Illumina NextSeq 2000系统上对它们进行测序，进行病原体检测、抗菌素耐药性(AMR)监测和功能分析的性能对比。

在所有样本中，与NextSeq 2000系统相比，在Onso系统上使用Zymo分析工作流对每个分类水平进行测序产生了更多的分类群。这意味着PacBio SBB比SBS检测到更多的微生物多样性。 

Onso系统上的SBB也比NextSeq 2000系统检测到更多的抗菌素耐药基因。这在很大程度上是由于Onso系统比竞争对手具有更高的检测灵敏度。

尽管流行病学与肿瘤学研究有很大不同，但这两个领域都具有众所周知的挑战性样本类型，并且需要高灵敏度和特异性，而人类健康受到威胁。Onso系统证明了更好的检测意味着更好的结果。

SBB的高精度为研究人员提供了必要的工具，用于监测和预测疫情，优化公共卫生管理和水处理战略，并为更好的公共卫生政策提出建议。

较低的复制率意味着更少的生殖系变异检测浪费读取

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解决临床可操作的信息要求高准确性。此外，随着测序能力的提高，临床测序已经从更有针对性的区域转向全外显子组和全基因组。这种转变意味着最高精度的测序不仅是理想的，而且是绝对必要的，以避免临床信息中的错误，这些错误可能影响治疗决策和对疾病的更深层次的理解

PacBio和Twist Bioscience之间的另一项合作，展示了Onso系统上的SBB如何在准确性问题上再次发挥作用。在本研究中，使用Twist 's Enzymatic Fragmentation 2.0试剂盒对8个重复的NA12878 gDNA进行了片段化。使用Twist Exome 2.0面板捕获感兴趣的区域，使用Onso库转换工具包转换现有的P5/P7库。研究人员随后在Onso系统上使用2 x 100 bp reads进行全外显子组测序，并将其与SBS进行比较。

他们的研究结果表明，Onso系统上的全外显子组测序在读取、输出和准确性方面超过了系统规格。 

表1

度规	规范	运行1	运行2
总读	800米	1062米	1107米
读取长度	2 x 100	2 x 100	2 x 100
输出	80 Gb	116 Gb	119 Gb
准确率(90% Q分)	40	49	44

 

他们还发现，在测量超过30倍覆盖率的碱基百分比、覆盖率均匀性和重复率时，Onso系统上的SBB的表现与SBS相当或更好。这种效果在医学相关区域更为明显，以ACMG 81(包含致病或可能致病变异的81个基因的列表)为代表。与SBS相比，SBB的低复制率意味着更少的浪费读取。 

总之，这些结果突出了Onso系统的SBB对临床外显子组测序和疾病研究中的变异检测的价值。要了解更多细节，您可以浏览公共数据集。

对癌症研究中变异检测的高灵敏度和特异性

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如上所示，液体活检应用于基础研究和潜在的诊断研究是一种很有前途的无创方法，但由于无细胞DNA (cfDNA)浓度低，基于ngs的样本分析具有挑战性。传统的短读测序技术一直在努力捕捉这些罕见的DNA片段，并以可靠检测所需的灵敏度和特异性对它们进行测序。

PacBio和IDT之间的合作展示了Onso短读测序仪如何成功检测急性髓性白血病(AML)样本中的低频变异。本研究采用IDT xGen高转换文库制备技术，从AML cfDNA和片段化gDNA参比样品制备文库。

合作者测试了这一工作流程，DNA输入范围从1纳克到50纳克cfDNA，以模拟在真实患者样本中发现的少量DNA。所有文库，即使是低输入1 ng，也有>99.9%的reads与参考文献对齐，≥75%的碱基与目标一致，考虑到小面板尺寸(~9 kb)，这尤其令人印象深刻。

当在Onso系统上测序时，转换后的xGen文库产生了非凡的准确性:96%的Q40+碱基和83%的Q50+碱基。这种水平的测序精度在其他短读测序仪上是闻所未闻的，比如SBS系统。即使对于低至1 ng的输入，Onso系统在250K reads/sample下对gDNA参考样本的灵敏度为>99.5%，特异性为≥99.7%，并且即使在非常低的次采样深度(<24K reads/sample)下也能保持性能。cfDNA参考样本的表现同样令人印象深刻，即使变异等位基因频率(VAFs)低至0.5%，也能达到100%的灵敏度和≥99.7%的特异性。

SBB精度和低噪声使卓越的灵敏度和特异性跨越10倍的读取深度范围。这些结果证明了调整测序深度以实现实验目标的可能性-与现有方法相比，更深的测序深度是体细胞变异检测的标准，这是一个令人耳目一新的变化。

Challenges of Accuracy in Germline Clinical Sequencing Data.