利用HiFi在遗传性共济失调领域获得新的重要发现

【字体：大中小】 时间：2024年06月07日 来源：基因有限公司

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　　近日，中南大学湘雅医院神经内科江泓教授团队在遗传性共济失调领域取得重要研究进展，在柳叶刀子刊《eBioMedicine》（电子生物医学）（IF=11.1）上发表研究论文。

背景介绍

脊髓小脑性共济失调（SCA）是一大类具有高度临床异质性和遗传异质性的神经系统遗传病，目前已有超过50种亚型被报道，最近发现的SCA27B/GAA-FGF14是由成纤维细胞生长因子14（FGF14）基因内含子区GAA扩增引起的，其致病范围（GAA）250-299属于不完全外显，（GAA）≥300属于完全外显。SCA27B的共济失调常表现为45岁后发病、发作性症状和下跳性眼球震颤，目前认为是欧美晚发型小脑共济失调最常见的原因之一，但缺乏中国共济失调人群的系统研究。研究发现，中国共济失调人群中SCA27B的发病率为1.3%，明显低于欧美地区，且合并获得性或其他遗传疾病可能会导致其表型变异和不同的疾病进展速度差异。

近日，中南大学湘雅医院神经内科江泓教授团队在遗传性共济失调领域取得重要研究进展，在柳叶刀子刊《eBioMedicine》（电子生物医学）（IF=11.1）以论著形式，发表了题为“The genetic landscape and phenotypic spectrum of GAA-FGF14 ataxia in China: a large cohort study”（中国GAA-FGF14共济失调的遗传和表型谱：一项大型队列研究）的研究论文。

本研究结合PacBio HiFi 测序及WGS测序，首次报道了FGF14双等位基因（GAA）202/222可能致病；在母系传递过程中，FGF14的GAA重复范围可由非致病区间（GAA）200–249扩展为致病区间（GAA）≥250。这些发现极大丰富了SCA的遗传和表型谱，为SCA27B的基因诊断和遗传咨询提供了重要依据。

GAA-FGF14 扩增的分布

参与此次队列研究的为2013年至2022年中南大学湘雅医院神经内科纳入的1216例指标病例，包括399例典型LOCA (迟发性小脑共济失调，发作年龄 > 30岁) ，290例EOCA (早发性小脑共济失调，发作年龄≤30岁)和527例占主导地位的典型小脑共济失调（MSA-c ）患者，并通过long-range PCR和RP-PCR进行FGF14 GAA 扩增的筛选。在1216名患者中，93.8% (n = 1141)的患者携带8~234个GAA repeat 的等位基因(图1a 和 b)。有趣的是，通过PacBio HiFi 长读长测序（target LRS）发现，来自LOCA 队列(P-1和 P-2)的一对同胞兄弟被发现是(GAA)202和(GAA)222等位基因的复合杂合子，两者都在40岁时呈现出缓慢进行性小脑共济失调并伴有步态共济失调、上肢共济失调和构音障碍。其他该家族成员的共分离分析显示(GAA)202和(GAA)222等位基因可能不是致病性的，但(GAA)202/222等位基因的复合杂合性可能与典型的GAA-FGF14共济失调相关。

图1. GAA-FGF14基因扩张的遗传分布、long-range PCR、repeat-primed PCR和遗传不稳定性。(a)在典型的 LOCA，EOCA 和 MSA-c 队列中FGF14基因中长三联重复单位的百分比和数量的分布。对于正常 GAA 重复(b) ，(GAA)≥250扩增(c)和(GAA)≥250扩增(d)的患者的对照，long-range PCR和repeat-primed PCR结果。(e)在9个不同的母体减数分裂事件中(GAA)≥250扩增传递的重复长度变异。(f) GAA-FGF14基因扩增在一个家庭中的两代传播

在1216例指标病例中，其余75例先证者被发现携带至少250个三核苷酸重复的FGF14 GAA 扩增(21例典型 LOCA、29例EOCA和25例MSA-c）（图2）。他们其中有4例LOCA患者(P12，P-14，P-15和 P-16) 、3例EOCA 患者(P-3，P-4和 P-11)和3例MSA-c患者(P-17，P-18和 P-19)携带有不间断的纯GAA扩增，范围从250~302个重复。在其他65例携带中断非GAA纯扩增的患者中，56例接受了随后的PacBio HiFi 靶向长读长测序（靶向LRS），9例由于DNA数量或质量不足而被排除在外。靶向LRS结果显示，14例典型LOCA 患者、21例EOCA患者和21例MSA-c患者携带有一个[(GAA) n (GCA) m ] z 扩增，总三核苷酸重复次数为296~726次，GCA重复次数为41~273次(图3)。其中，EOCA (P6和P-8)的两个先证者携带与疾病共分离的(GAA)≥250 - [(GAA) n (GCA) m ] z 扩增。其他54名患者(14典型LOCA，19名EOCA和21名MSA-c)携带[(GAA) n (GCA) m ] z 扩增而不含(GAA)≥250扩增，其不与疾病表型共分离。在研究者使用的内部对照数据库(3/150)中也存在不含(GAA)≥250的[(GAA) n (GCA) m ] z 扩增，表明这种扩增与＜250个纯GAA的重复序列可能是多态性而不是致病性的。

图2. GAA-FGF14阳性病例的家系图和共现筛查。(a)13例 GAA-FGF14阳性家系。家族4和家族5的患者在FGF14基因中有(GAA)≥250-[(GAA) n (GCA) m ] z 扩增。(b)在家族2中，先证者(P-3)被Sanger测序鉴定为在 COL1A2基因中具有 c.1801 G > A 的杂合变异。(c)在家族3中，通过 Sanger 测序进行的共分离分析显示，父母双方在NEU1基因中具有 c.544 A > G 的杂合变体。(d)在家族4中，先证者(P-6)在ATXN3基因中被鉴定为(CAG)78扩增。(e)在家庭5中，先证者(P-8)和她的妹妹(P-9)被鉴定为在 ATXN1基因中具有(CAG)50扩增

图3. 靶向LRS显示FGF14基因 GAA-GCA和GAA基序的复杂结构。(a) IGV快照显示具有杂合重复扩增的代表性患者(ID57)。(b)序列条形图描绘了在四个样品中观察到的较短等位基因的大小，包括常见的5’-侧翼序列变体(TAGTCATAGTACCCCAA)1和GAA 重复。(c)基序柱状图显示了在这些样品中观察到的较长等位基因的基序构象。内部STR 三核苷酸主要由GAA和GCA 组成，包括不同形式的GAAGCA 和(GAA)4GCA，并被GA和 GAAA中断。(d) IGV图描绘了ID01(P-1)样品中的双等位基因(GAA)202/222扩增

表型分析

临床谱和亚组分析19例阳性和可能阳性患者，根据其临床表型分为 LOCA 亚组(n = 9) 、EOCA 亚组(n = 6)和 MSA-c 亚组(n = 4)。在 LOCA 亚组中，6例来自典型的LOCA队列、3例来自EOCA家族，表现为迟发性缓慢进行性小脑共济失调。他们的临床特征与在欧洲 GAA-FGF14共济失调队列中观察到的相似。其余10例显示非典型GAA-FGF14共济失调，包括6例EOCA表型(均来自 EOCA 队列)和4例MSA-c表型(1例来自典型 LOCA 队列，3例来自MSA-c 队列)。有趣的是，在家族10中，家族成员呈现缓慢进行性LOCA表型，但先证者(P-16)表现出MSA-c表型，表明先证者中可能存在继发性MSA-c。因此，来自家族10的先证者被分类为MSA-c 亚组。

LOCA、EOCA和MSA-c亚组GAA重复的中位数分别为294(范围从250~357个GAA重复) 、335(范围从277~416个GAA 重复)和267(范围从264~275个GAA 重复)。与MSA-c亚组相比，EOCA亚组显著表现出更高的GAA 重复次数。与欧洲GAAFGF14共济失调队列61岁(37-78岁)发病的中位年龄相比，在此次研究的LOCA亚组中，发病的中位年龄为47岁(40-60岁)。所有患者中最常见的永久性共济失调特征是步态共济失调(9/9,100%)和凝视诱发的水平眼球震颤(7/7,100%) ，而6例患者出现发作性症状，包括眩晕或头晕(4/9,44%) ，发作性共济失调(3/7,43%)(图4)。

图4. LOCA，EOCA 和 MSA-c 表型患者的临床特征

结论

在这项研究中，作者探索了我国GAA-FGF14共济失调的遗传和临床谱，发现在大型中国LOCA 队列中 FGF14 GAA 扩增的频率为1.3% ，低于以前在非亚洲共济失调人群中报道的频率。由于不同的遗传基础，GAA-FGF14阳性的LOCA，EOCA和MSA-c病例表型在发病年龄、临床特征和疾病进展方面存在差异。

利用PacBio HiFi测序技术得到的一个新发现是：重复次数少于250次的双等位基因(GAA)202/222与其他遗传或疾病(特别是在具有非典型表型的情况下)共同出现可能会更加导致疾病发作和表型变异。

PacBio HiFi技术与二代测序技术相比，因其读长可达25kb、无GC偏好性且单分子准确率≥99.9%、可以全面检测出包括SNP、Indel、SV、串联重复、CNV等在内的所有变异类型，因此在本研究中能够对重复序列有效且准确的检测。

PacBio HiFi 技术优势