Nature发不停! MERFISH助力小鼠全脑分子水平空间分辨率的细胞图谱绘制

什么是MERFISH?

MERFISH(Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization) 是基于多轮原位探针杂交和超分辨荧光显微成像技术相结合的空间转录组检测技术。MERFISH是多重纠错荧光原位杂交技术，基于其稳健的抗错机制得以保证实验结果的精确性和一致性。

研究背景

在哺乳动物的大脑中，数以百万计到十亿计的细胞形成复杂的相互作用网络以实现广泛的功能。而细胞的巨大多样性和错综复杂的组织阻碍了我们对大脑功能的分子和细胞基础的理解。近几年在空间转录组学方面的研究进展使得能够系统地绘制包括几个脑区在内的复杂组织中的细胞类型空间分布，然而仍缺少一个全脑单分子水平的细胞空间分布图谱。

在2023年12月发表在Nature上的《Molecularly defined and spatially resolved cell atlas of the whole mouse brain》一文中，哈佛大学研究团队使用高分辨率MERFISH技术，对成年小鼠全脑约1000万个细胞和超过1100个基因进行了成像，在全转录组水平上进行了空间分辨率的单细胞表达谱分析。

01 小鼠全脑的MERFISH成像

作者在横跨四个成年小鼠整个大脑半球的245个总冠状切片和矢状切片中共成像了超过1,100个基因，包括以100μm 间隔(动物1，雌性)或200μm 间隔(动物2，雄性)的连续冠状切片和200μm间隔的连续矢状切片(动物3和4，雄性)(图1a)。此次得到的MERFISH数据不仅表现出极好的重复性(扩展图1a)，并且获得的每种基因的单细胞平均拷贝数与全脑bulk RNA-seq及 scRNA-seq 数据相关性良好(扩展图1b，c)。总的来说，研究者在成年小鼠的全脑中成像了大约1000万个细胞，覆盖11个主要的大脑区域: 嗅觉区域、新脑皮层(CTX) 、海马结构、皮质板、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑、后脑和小脑。

02 细胞分类和注释

由 MERFISH 测量的空间信息被用来注释由 scRNA-seq 鉴定的细胞类型，除了一些先前注释良好的细胞类型，每个神经元亚类命名有三个部分: 亚类主要分布的大脑区域、一个或多个marker基因以及使用的主要神经递质。同样基于marker基因和特定的空间信息对非神经元细胞亚类进行注释（见图1 c d)。

图1. 基于分子水平和空间分辨率的整个小鼠大脑的细胞图谱   c，整合的基于MERFISH和scRNA-seq 数据的UMAP (左)。冠状切片和矢状切片中的不同细胞类型的空间图谱(右)。d，11个主要脑区以及纤维束和心室系统的冠状切片和矢状切片的细胞空间分布图。

03 神经元的多样性与空间分布

总体来说，整个小鼠大脑由46%的神经元和54%的非神经元细胞组成。这个比率在不同区域之间差异很大，后脑和小脑分别显示出最低和最高的神经元-非神经元细胞比率(图2a)。神经元表现出非常高的多样性，包括315个亚类和超过5000个簇。神经元细胞类型也表现出强烈的区域特异性，11个主要区域包含不同数量的细胞类型，特别是后脑、中脑和下丘脑比其他脑区含有更多的神经元细胞类型(图2b)。

根据神经递质转运蛋白和参与神经递质生物合成的基因的表达，将成熟的神经元分为八个组: 谷氨酸能(表达Slc17a7，Slc17a6和/或Slc17a8) ，GABA 能(表达Slc32a1) ，5-羟色胺能(表达Slc6a4) ，多巴胺能(表达Slc6a3) ，胆碱能(表达Slc18a3) ，甘氨酸能(表达Slc6a5) ，去甲肾上腺素能(表达Slc6a2)和组胺能(表达Hdc)神经元。在这些组中，谷氨酸能和GABA能神经元分别占总神经元群体的约63%和36% ，而5-羟色胺能、多巴胺能、胆碱能、甘氨酸能、去甲肾上腺素能和组胺能神经元仅占总神经元群体的约2% (图2c，左)。谷氨酸能神经元和 GABA 能神经元广泛分布于整个大脑，分为不同的细胞类型，具有不同的空间分布(图2d，e）。研究人员还观察到两个亚类的未成熟神经元(IMN) : 一个抑制性和一个兴奋性(图2f，左)。由30个clusters组成的抑制性IMN沿脑室下区(SVZ)分布，通过前连合延伸至嗅球(图2f) ，兴奋性IMN由七个clusters组成，分布在两个不同的位置: 嗅觉区域的梨状区域和海马结构的齿状回(图2f，右) 。

图2. 神经元的细胞类型组成和空间分布. a、大脑11个主要区域的神经元和非神经元细胞的占比。b、11个主要大脑区域中每种神经元亚类的富集分数的热图。c，条形图显示了在整个大脑(左边两个图)和不同的脑区中(右边两个图)使用不同神经递质的神经元的占比。d，谷氨酸能(左)和 GABA能(右)神经元亚类在冠状切片和矢状切片中的空间分布图。e，谷氨酸能神经元(左) 、GABA能神经元(中)和表达各种调节性神经递质的神经元(右)的空间分布图。f，IMNs的UMAP图和空间分布。

04 非神经元细胞的多样性与空间分布

非神经元细胞包括23个亚类和117个clusters (图3a )。研究人员量化了11个主要脑区域以及非神经元细胞占主导地位的纤维束和心室系统中的非神经元细胞类型组成和富集(图3b，c )。在整个大脑中，非神经元细胞由30%的少突胶质细胞(OGCs)、6%的少突胶质前体细胞(OPCs) 、28%的血管细胞(内皮细胞，周细胞，血管软脑膜细胞(VLMC) 、平滑肌细胞(SMC)和蛛网膜屏障细胞) 、23%的星形胶质细胞、8%的免疫细胞(小胶质细胞、边缘相关巨噬细胞(BAM) 、淋巴细胞、树突状细胞和单核细胞)和5%其他细胞类型共同组成(图3b)。

图3. 非神经元细胞的细胞类型组成和空间分布. a、非神经元细胞的UMAP图 ; b、条形图显示主要非神经元细胞类型在整个大脑的占比; c、热图显示11个主要大脑区域以及纤维束和心室系统中所有非神经元亚类的富集分数; d、31个星形胶质细胞clusters的空间分布; e、一个矢状面上de OGC和OPC的空间分布; F，七个冠状切片中第三脑室(V3)中三个室管膜和八个鞣质细胞簇的空间分布图。

05 细胞-细胞相互作用和通讯

研究人员参考亚类水平的细胞类型，并通过对给定细胞类型对之间观察到的体细胞接触或接近频率是否高于随机机会来推断单个脑区域中的细胞类型特异性细胞-细胞相互作用，补充了配体-受体对的表达变异分析(图4a)，确定了几百对统计学数据显示相互作用显著的细胞亚类(图4b，c)。作者预测的细胞-细胞相互作用包括非神经元细胞之间、非神经元细胞与神经元之间以及神经元之间的相互作用。

经过数据分析和成像显示，可观察到血管细胞和免疫细胞之间的相互作用（内皮细胞和周细胞都显示出与 BAMs、脑内巨噬细胞的显著相互作用）(图4d，e)。内皮基底膜层粘连蛋白可促进单核细胞向巨噬细胞分化，因此，这些细胞-细胞间的相互作用可能对调节大脑中的巨噬细胞库发挥作用。作者还观察到小胶质细胞与这两种血管细胞类型之间的显著相互作用(图4f)。与内皮细胞相比，周细胞与小胶质细胞相互作用的可能性更高，而与 BAM 相互作用的可能性则相反(图4g)。

图4. 细胞与细胞间的相互作用和通讯 a、细胞-细胞相互作用分析示意图(左)和配体-受体(LR)分析示意图(右)。近似表示接近距离阈值; 如果两个单元的质心位置之间的距离在这个距离阈值内，则认为它们是接触或接近的。b、整个大脑的细胞间相互作用。每条线对应于一个预测的相互作用的细胞类型对。灰线表示非神经元细胞与神经元之间或非神经元细胞之间的相互作用; 红线表示神经元与神经元之间的相互作用。c、两个大脑区域的细胞-细胞相互作用。每条线对应于一个相互作用的细胞类型对，颜色表示接近频率的倍数变化。d、内皮细胞与BAM的相互作用，单元格的示例图像以红色和蓝色显示相互作用的细胞类型，所有其他细胞类型以灰色显示。e，与 d 相同，但是周细胞和BAM之间的相互作用。f，内皮细胞与小胶质细胞之间的相互作用(左)和周细胞与小胶质细胞之间的相互作用(右)。g，观察到的近端细胞对数目相对于不同脑区零分布平均值的倍数变化。

划重点

MERFISH的价值

利用MERFISH技术最终得到的超高分辨率细胞空间表达谱，使我们能够推断数百个细胞类型对之间的细胞特异性相互作用，并预测这些细胞-细胞相互作用的分子(配体-受体)基础和功能意义。这些结果极大丰富了对大脑细胞结构和分子水平上的见解，奠定了对神经回路及其在疾病中功能障碍研究的基础。

Vizgen MERSCOPE™

2021年，Vizgen率先将整合了MERFISH与超分辨率成像技术的分析系统MERSCOPE™推向市场。基于核心技术MERFISH技术，MERSCOPE™可在1天内对1cm²的组织进行超分辨成像，分辨率100nm，定位单细胞中RNA的空间分布以及定量基因表达。实现真正意义上的原位单细胞空间转录组分析，让基因的表达和定位可视化，推动基因组学的研究步入下一代。

基因有限公司于2022年3月正式签约成为美国Vizgen公司MERSCOPE™超分辨显微成像分析系统在中国区的合作伙伴。负责该仪器的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。同时，上海贝晶生物技术有限公司也提供MERFISH技术服务。想要了解关于更多有关MERFISH的技术信息，可添加下方微信。