哪种酶最适合NGS文库扩增？Sanger研究所做测评

　　

在新一代测序（NGS）中，许多文库制备方法都需要用到PCR扩增。尽管许多PCR酶能高效、准确且特异地扩增单个靶点，但很少有酶是专为NGS设计的，能够无偏倚地扩增不同大小和GC含量的靶点。

为此，Wellcome Sanger研究所的研究人员近日对20多种高保真PCR酶进行测评，以选择最适合短读长测序和长读长测序应用的PCR聚合酶和产品。这项成果发表在《Microbial Genomics》杂志上。

在测试的20多种酶中，他们发现Quantabio公司的RepliQa HiFi ToughMix、Watchmaker公司的Equinox Amplification Master Mix以及Takara公司的Ex Premier DNA聚合酶是扩增短读长文库的“首选酶”。同时，Quantabio公司的RepliQa HiFi ToughMix也在长读长文库扩增竞赛中脱颖而出。

Wellcome Sanger研究所负责测序研发的首席科学家Michael Quail领导了这项工作。他的研究团队曾在十年前评测了在短读长Illumina文库扩增中表现最佳的酶。他们当时选出了Roche公司的Kapa HiFi DNA聚合酶，并将结果发表在《Nature Methods》杂志上。

Quail表示：“在过去的十年中，各家公司都开发出了新的PCR酶。我们想用一些新产品来重复这项研究。”

在这项新研究中，研究人员比较了20多种市售的高保真PCR酶产品，它们来自众多的NGS样本制备试剂供应商，包括Roche、Takara、Thermo Fisher Scientific、Agilent Technologies、New England Biolabs、Bio-Rad Laboratories和QIAGEN等。

为了对短读长扩增的各种酶进行基准测试，研究人员以四种GC含量不同的微生物基因组作为PCR模板来制备Illumina测序文库，它们分别是：百日咳杆菌、大肠杆菌、艰难梭菌和恶性疟原虫。

对于测试的每种酶，他们使用制造商建议的变性和延伸时间，以1 ng文库片段为模板进行14个循环的扩增。他们发现Quantabio RepliQa、Kapa HiFi、Invitrogen Platinum SuperFi II、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier等酶的产量较高。

同时，Quantabio RepliQa、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier对所有的基因组都表现出很好的覆盖均一性。此外，这三种酶扩增后检测SNP和插入缺失时的灵敏度最高。

在长读长测序的文库制备过程中，长距离PCR通常更有挑战性，因为产量较低，而且扩增过程偏向于较小的片段。为了测试PCR酶在这种应用中的适用性，研究人员制备了21.6 kb和13.3 kb的酵母DNA片段，并在添加Illumina接头后作为模板。

他们发现，Quantabio RepliQa和Takara Terra聚合酶带来了最长的插入片段，约为12 kb。不过作为Taq的衍生物，Terra的错误率较高。在将测序文库用于PacBio测序时，RepliQa和Terra聚合酶也给出了最连续的组装结果。

研究人员认为，不同PCR酶在扩增片段的产量和均一性方面存在明显差异。他们认为Quantabio RepliQa、Watchmaker Equinox和Takara Ex Premier可扩增极端的GC含量，其覆盖偏倚与PCR-free数据相似。

“令人惊讶的是，不同酶之间的产量差异很大，这再次说明用户应当精心挑选PCR酶，因为使用低效的酶可能会导致产量偏低，因此用户需要采用更多的PCR循环，从而使偏倚更严重，”作者写道。