克服癌症样本的挑战，成功开展NGS分析

新一代测序（NGS）技术在推动癌症研究方面发挥了重要作用，它有助于鉴定致癌突变、发现转录组变化，并深入了解肿瘤微环境。然而，癌症研究往往依赖于困难的样本类型，而从这些样本中获得有价值的测序数据仍面临诸多挑战。

尽管存在这些挑战，但一系列新兴技术能够优化NGS样本质量，并推动癌症研究的发展。下面让我们来听听专家的建议。

样本类型和挑战

Standard BioTools（原Fluidigm）公司的产品管理总监Bill Hunt解释说：“每种样本类型都有其自身的挑战，首先是组织样本，其采集需要侵入式操作，既痛苦又昂贵。此外，可能还需要从病变组织中采集多个样本，才能获得有代表性的信息。”

Hunt还强调了几种特别有挑战性的样本类型。例如血液样本，它们富含蛋白质，可能会影响生物标志物的测定，需要特殊的采集、储存和处理方案。此外，循环肿瘤细胞（CTC）也是个老大难，因为它们在血液中的丰度很低。

Hunt还提到，外周血是生物医学和临床研究中的宝贵样本，但利用全血来发现生物标志物还存在不少困难。尽管通常认为重要的生物标志物存在于含有外周血单核细胞（PBMC）的全血中，但分离PBMC既困难又费钱，还会改变其转录图谱。

此外，Hunt还指出，珠蛋白（globin）转录本可能在红细胞中占大部分，并构成全血中RNA的70%。这种珠蛋白转录本的普遍存在会大大掩盖RNA测序文库中的其他读数，为分析增添了复杂性。

安捷伦公司NGS分析开发的研发总监Michael Ruvolo认为，肿瘤活检对癌症研究至关重要，但由于采集过程的性质和样本量有限，活检分析仍存在挑战。他指出了FFPE组织、液体活检或血浆样本面临的问题，并指出“FFPE组织的困难在于保存方法，这会造成DNA和RNA损伤，大大降低质量和回收率”。

对于液体活检样本，Ruvolo表示，由于游离DNA（cfDNA）极少且这种DNA处于降解状态，故分析过程存在一定难度。对于这两类样本，往往只有一次提取核酸的机会，因此对研究人员来说样本弥足珍贵。

PacBio公司的癌症基因组学副总监Jonathan Bibliowicz则强调，随着癌症基因组学向长读长测序转变，必须获得高质量的高分子量（HMW）DNA。然而，FFPE等传统技术往往会造成样本降解，从而导致结果不理想。这就催生了专门的样本提取方案，以期优化DNA质量、减少片段化并提高测序成功率。

克服样本制备的挑战

好在，如今的一些创新解决方案可帮助研究人员克服这些挑战，提高癌症研究中NGS样本的质量。对于全血样本，Hunt建议将珠蛋白去除方案与Advanta™ RNA-Seq NGS文库制备试剂盒等工具结合使用。

在处理冷冻全血样本时，采取快速解冻程序可减少RNA降解，提高核酸的产量和质量。为了进一步保护DNA，Hunt建议对样本进行轻柔处理以避免溶血，同时尽量避免暴露在光照和高温下，因为这也会造成损伤。

此外，Hunt还解释说，CTC是癌症预后的重要指标，需要采用多种方法对其进行富集和分析。它们在血液中的存在情况随着肿瘤的脱落率和本身的异质性而变化，这也影响到可检测的CTC标志物。

目前人们还能从恶性胸腔积液和腹腔积液中采集CTC，但其DNA含量往往很低。考虑到DNA稀少，研究人员可以采用微流控方案进行文库制备，以便保留珍贵的样本用于其他检测。

另一个关键策略是选择高分子量DNA提取方法。Bibliowicz解释说，这个领域的一大创新是Nanobind提取方法，它采用专门的磁盘，这些磁盘包被了多孔硅基材料，可有效结合和释放高分子量DNA。它能够提取高分子量（50-300 kb）或超高分子量（>1 Mb）DNA。PacBio最近还推出了Nanobind PanDNA试剂盒，支持多种类型的样本。

Ruvolo还建议人们选择值得信赖的靶向文库制备方法。这些方法，包括安捷伦最新的SureSelect试剂盒，可以处理起始量有限的DNA或RNA，生成高质量的文库。对于游离DNA样本等更具挑战性的样本类型，安捷伦Avida技术可从单个样本中捕获DNA变异和甲基化改变，而无需拆分样本。当然，自动化方法可进一步确保样本之间的一致性。

最后，Ruvolo分享说，追踪DNA或RNA的质量或完整性也是一个重要步骤，需要在NGS流程中开展质量控制（QC）分析。质控指标可以提供有价值的信息，帮助你确定样本和文库的质量和数量是否足以进行下一步。例如，%cfDNA评分有助于区分下游实验的可用样本和高分子量污染。

利用安捷伦的片段分析仪、TapeStation和Femto Pulse等自动化电泳系统，研究人员可以使用最少的样本量来有效监控DNA和RNA的完整性。Bibliowicz指出，PacBio强烈建议使用Femto Pulse系统，认为它是准确分析长片段DNA和质量检查的最佳方法。

尽管众多的样本类型和保存方法让癌症研究变得更复杂，但上面的这些解决方案和先进技术可改善分析过程，帮助研究人员优化样本质量，并成功开展NGS实验。