《Science》一种有效抑制基因的表观遗传编辑器

一种新的表观遗传编辑器，它可以沉默鼠大脑中朊蛋白(PrP)的表达，并为神经退行性疾病的治疗提供了一种新的方法。

　　

尽管近年来分子医学的实践已经取得了巨大的进步——反义寡核苷酸(ASO)疗法的批准以及第一个基于CRISPR的疗法证明了这一点——神经退行性疾病，如朊病毒病、亨廷顿病、阿尔茨海默病和帕金森病，仍然是一个艰巨的挑战。毒性蛋白聚集与神经变性有关，这表明基因沉默是一种广泛适用的治疗策略。尽管ASOs和基于CRISPR的沉默提供了抑制致病蛋白表达的潜力，但尚未取得成功。

ASOs通过结合靶mRNA并诱导其降解、剪接修饰和其他改变其翻译可用性的修饰来损害蛋白质合成。虽然临床前疗效已被证明与ASO治疗。对于小鼠模型中的朊病毒疾病。到目前为止，在临床上的成功要么是缺乏的，要么是有限的。ASOs也有很大的技术限制，包括其短期疗效需要反复鞘内注射(进入椎管)和药物不良反应的风险，如脑积水、脑膜炎和肝毒性。基于CRISPR的沉默技术提供了另一种方法，将催化死亡的Cas蛋白拴在效应域上。最初的“表观遗传编辑”尝试使用的抑制因子结构域被证明只能使基因短暂沉默。

CRISPRoff是最近开发的一种表观遗传编辑器，它含有DNA甲基转移酶结构域，可以通过启动子的定点甲基化实现更持久的基因沉默。尽管取得了这些进展，但仍然存在一些重要的局限性:腺相关病毒(AAV)载体仍然是将转基因传递到大脑的主要手段。CRISPRoff太大，无法装入单个AAV载体；AAV载体促进长期编辑表达，带来有害免疫反应和脱靶编辑的风险，组构活性效应酶的束缚可导致无节制的脱靶效应和细胞毒性。

甲基转移酶(CHARM)是一种紧凑、无酶的表观遗传编辑器，可以招募内源性DNA甲基转移酶，诱导靶基因启动子的超甲基化，并在通过单个AAV载体递送小鼠大脑后持久地沉默基因的表达，从而使其蛋白产物的产生。这种创新的方法解决了现有编辑方法的每个限制。

基于CRISPR的编辑工具由于其复杂性和大小而具有挑战性。尽管含有mRNA的脂质纳米颗粒可以有效地将大型编辑器递送到肝。目前它们瞄准其他器官(如大脑)的能力有限。为了实现高效的非肝脏递送，需要多种AAV载体来容纳大尺寸的表观基因组编辑器，如CRISPRoff。但这种策略意味着降低效力，增加AAV剂量来补偿，从而增加毒性。

通过摆脱CRISPR的使用，并创建一个模块化的基于锌指的“ZFPoff”表观基因组编辑器，它不需要大的蛋白质结构域——锌指DNA结合基序比Cas蛋白小得多。

使用系缚酶可以增加编辑效力，但可能产生不良后果。一个公认的例子是由CRISPR碱基编辑器进行的不依赖于引导RNA的脱靶编辑，其中束缚的脱氨酶结构域可以随机改变整个基因组和转录组中的DNA和RNA序列。证实细胞毒性是CRISPRoff中使用的组成活性甲基转移酶结构域[D3A，源自哺乳动物DNA甲基转移酶3A (DNMT3A)蛋白]的问题，特别是在ZFPoff中与锌指一起使用时。

根据DNMT3A调节的自然机制，从编辑器中移除D3A结构域，并使用非酶促DNMT3L c末端结构域(D3L)和组蛋白H3尾部的融合，它们一起将内源性和非活性DNMT3A特异性地招募到目标基因组位点并原位激活它，从而避免任何普遍的细胞毒性。D3L-H3尾部融合是相当小的，这意味着多达三个正交的表观遗传编辑器(针对不同的基因组区域)可以通过一些涉及分裂内链的巧妙工程融入一个AAV载体。

Neumann等人通过展示编辑工具长期表达可能带来的潜在不良影响的自我沉默能力，克服了这些担忧。他们让其中一个编辑器靶向AAV载体中的启动子，从而关闭所有编辑器的表达。CHARMs可以被编程来调节这种自我沉默，以优化治疗性基因沉默和编辑器表达的短暂性之间的平衡。另一个安全优势是CHARMs缺乏细菌表位（与基于CRISPR的工具不同），因此它们的免疫原性可能比其他表观遗传编辑器更有利。

在体内对PrP蛋白应用CHARM介导的表观遗传编辑时，确立了其有效性和持久性。AAV传递的CHARMs——包括自我沉默的CHARMs——靶向Prnp启动子，实现了大脑中Prnp转录本和PrP蛋白水平的广泛降低，并在治疗后长达13周的时间内Prnp启动子发生高甲基化。基于先前的工作，预计这种效果将延长朊病毒病小鼠模型的生存期，也许对人类患者也是如此。

随着CHARMs的发展，Neumann等人引入了一种强大且安全的基因沉默编辑技术，通过AAV传递到通常难以靶向的器官，如大脑。限制包括对通过甲基化对PRNP和其他疾病位点进行基因沉默的长期持久性的不确定性，这尚未得到保证，需要逐案确定。需要克服的额外挑战是，基因沉默可能仅对某些疾病有用，并且锌指引发的非目标编辑的潜力比CRISPR基工具定义得不那么明确。尽管如此，类似于CHARMs的表观遗传编辑器最终可能被证明对人类健康的影响与其他变革性技术一样深远，如碱基编辑和先导编辑。

An epigenetic editor to silence genes