见所未见！双侧双光子显微镜让极限成像深度“再下探”

为了实现对高散射厚生物样本的长时程、大体积、高分辨率的三维成像观测，北京大学程和平/王爱民团队开发了双侧双光子显微镜（Dual Objective Two-photon Microscope, Duo-2P）。研究团队针对组织切片、类器官、发育胚胎和小生物体等样本体积小、致密且高度散射的特点，提出了一种具备双物镜的双侧双光子显微镜构型。

　　

光学显微镜成像技术

可以对神经元群体或个体实现功能和结构上成像

进一步解读脑神经的“身份秘密”

日前，江北新区南京生物医药谷

南京脑观象台最新研究成果——双侧双光子显微镜

持续下探极限成像深度

为脑科学研究提供重要技术支撑

对活体生物样本进行长时程、高分辨率的光学三维成像，对探索介观-微观水平的生理功能和系统行为至关重要。由于生物组织对成像光子的高散射特性，高分辨率的光学成像被限制在样本表层。多光子显微成像技术因其更长的激发波长和非线性激发特性，提供了更大的成像穿透深度，广泛应用于高散射生物样本的深层成像应用。然而，多光子显微镜的深层成像通常以更高激发功率或更长曝光时间为代价，对生物样本造成光损伤并限制了长时程成像应用。

为了实现对高散射厚生物样本的长时程、大体积、高分辨率的三维成像观测，北京大学未来技术学院程和平教授与北京大学电子学院王爱民副教授团队开发了双侧双光子显微镜（Dual Objective Two-photon Microscope, Duo-2P）。研究团队针对组织切片、类器官、发育胚胎和小生物体等样本体积小、致密且高度散射的特点，提出了一种具备双物镜的双侧双光子显微镜构型（图1）。

图1. Duo-2P成像系统

研究团队通过简洁而有效的显微镜构型设计，由双侧双光子激发和荧光收集，将极限成像深度扩展到两倍左右。对厚度约五个散射长度的生物样本，Duo-2P仅需传统双光子显微镜1/10的激发能量输入即可完成逐层光栅扫描的三维成像，极大地降低了活体成像的光损伤，并获得最高1.4倍的信噪比增益（图2）。此外，Duo-2P还成倍增加了成像体积。

图2. Duo-2P中双侧激发与荧光收集的模拟计算。(a) 图1(a)中虚线框内成像腔室放大示意图。(b) Duo-2P与传统双光子显微镜在不同成像深度的激发光功率比较。(c) 在不同样本厚度的体积成像时，Duo-2P与传统双光子的输入能量之比。(d) 成像深度(D)和离焦距离(Δd)对荧光收集效率(η)的影响。(e)与对侧荧光收集效率和荧光强度相关的信噪比增益计算结果

该成果以“Dual-objective two-photon microscope for volumetric imaging of dense scattering biological samples by bidirectional excitation and collection”为题，在线发表于Photonics Research。北京大学未来技术学院博士生翟慕岳为论文第一作者，程和平与王爱民为论文通讯作者。该成果得到国家自然科学基金与医学科学创新基金的支持。

论文封面

Duo-2P在研究团队对哺乳动物生物钟时间编码的研究工作中，完成对近万颗神经元的钙活动的跨昼夜成像记录，在获取生物钟运行数据、解析视交叉上核的时间编码机制中发挥了重要的作用。（Wang, Z., Yu, J., Zhai, M. et al. Cell Res. (2024)）研究团队也期待该技术在脑科学、发育生物学及类器官等生物学研究领域的广泛应用。

南京脑观象台：

南京脑观象台（Nanjing Brain Observatory, NBO）是北京大学分子医学南京转化研究院布局打造的高端成像平台。平台的宗旨是围绕全球脑科学计划的重大需求，倾力打造“自由行为动物脑成像”的核心能力，大规模获取脑动态图谱数据，推动重大原创发现，助力脑疾病临床新药创制，并启迪类脑与人工智能研究。

NBO配置微型化双光子荧光显微成像系统20余套，年可对外提供机时50,000+小时，年可服务500课题；拥有1500平方米SPF级动物房、2个万级负压动物房、3000笼大小鼠饲养空间。提供从动物手术、载体表达，到行为训练、组织切片，再到图像大数据处理、分析与可视化等多学科技术，为全球客户与合作者提供“高通量、定制化、一站式”的科技服务，并为全球脑科学的研究者们提供一个绝佳的技术交流与融合平台。