像核酸纯化一样快速高效、稳健低成本的蛋白质组学样品制备技术

蛋白质样品制备相比核酸纯化要麻烦太多。特拉华大学的研究人员开发了一种类似于核酸纯化硅胶膜一样易于使用、可靠且低成本的普通蛋白质组学样品制备方法，使得快速经济可靠地对样本进行质谱分析成为可能。

　　

特拉华大学化学与生物化学系蛋白质组学主任Yanbao Yu开发了一种用于蛋白质组学分析的蛋白质样品制备的简化方法，该方法快速、易于使用、价格低廉，并且普遍兼容现有蛋白质分析流程。Yu和他的合作者在6月11日发表在《 Cell Reports Methods》杂志上的一篇论文中报告了这种正在申请专利的方法的有效性。

了解细胞中蛋白质的数量或组成可以帮助研究人员了解在特定时间甚至一段时间内我们体内发生的事情。例如，某些蛋白质的存在或缺失可以作为一个人的生物学指标。一旦样本经过制备纯化，蛋白质组学科学家们可使用高灵敏度的质谱仪来确定特定蛋白质的身份。蛋白质样本制备通常需要处理血液、组织或其他生物材料的样本，使其可通过质谱法分析，这是关键。当前蛋白质组学分析在很大程度上受到缺乏一种通用样品制备方法的阻碍，这就是Yu的工作发挥作用的地方。

方法简单，效果好

Yu的方法以一种高效、有效和经济的方式简化了样品的制备，他称之为E3。他通过UD的经济创新与伙伴关系办公室(OEIP)正在申请专利。CDS公司是蛋白质组学样品制备耗材和仪器的领先供应商，拥有正在申请专利的UD技术的完全商业权利的独家许可。该方法将惰性玻璃微珠（GB）与CDS Analytical公司的Empore膜相结合，构建了一种性能强大的GB固定膜，可以集成到多种样品采集设备——如过滤器、移液器、卡盒（cartridges）或平板，提供了一个简单易用、成本更低的蛋白质组学样品制备平台。

他们将二氧化硅微珠固定到聚四氟乙烯基质中以构建一种强大的膜介质，能够以快速和低成本的方式，可靠地生成适用于蛋白质组学分析的样品。作者使用不同的形式对其性能进行基准测试，并使用不同复杂性、数量和体积的各种样本类型进行测示，结果表明这种e3技术可提供相当于或优于许多现有方法的蛋白质组鉴定和定量性能。作者进一步提出了一种增强的单管e4技术，可以以最小的样品损失和高灵敏度进行细胞内过滤消化，实现低输入和低细胞蛋白质组学。最后，作者利用上述技术制备RNA结合蛋白，并绘制了完整的细菌细胞蛋白质组。

技术指标

典型蛋白质组学分析的最终目标是分析生物样本的所有蛋白质——蛋白质组，以便揭示与生物学和/或病理学相关的分子和标记蛋白，尤其是那些丰度较低的分子和标记蛋白。因此，自下而上/散弹枪蛋白质组学实验的主要组成部分是样品制备，包括细胞裂解和蛋白质提取、清理和消化以及肽脱盐。高效细胞裂解是实现高产无偏蛋白质提取的关键。蛋白质完全变性后的消化，既可以在溶液中进行，也可以在固体载体上进行。

固定化色谱珠在聚四氟乙烯(PTFE)网被广泛地称为Empore膜。Empore 膜比游离珠粒具有很大的优势。这是因为松散的颗粒被困在 PTFE 基质中，使它们更容易操作（例如分装、转移等）。由于 Empore 膜可以方便地装入单个过滤装置或多孔板中，因此基于膜的样品制备很容易扩展和自动化，无需进行大量的方法调整或重新优化。基于以上优势，作者首次将 Empore 技术与 GB 结合起来，构建了固定化 GB 膜。他们测试过两种不同尺寸的 GB，一种在 10 μm 范围内，另一种在 30 μm 左右。对 GB 膜的初步检查显示，珠子被固定在适当位置并嵌入 PTFE 网中。初步消化实验表明，两种 GB 膜具有同等的识别性能。研究后续使用 30 μm GB 膜。

各种样本测试

首先制备分析大肠杆菌蛋白质组以评估 GB 膜的定性和定量蛋白质组学性能。将膜组装到0.5 mL 过滤装置中来构建原型 E3过滤柱。三个独立的消化实验，输入约 20 μg大肠杆菌裂解物并进行单次液相色谱-质谱 (LCMS) 运行，E3 filter 平均能够识别 2,207 种蛋白质和 17,358 种肽，这些结果始终高于同样在此测试的现有的 FASP 和 SP4-GB 方法。E3technology 具有出色的定量可重复性，E3filter 还比其他两种方法定量了更多的蛋白质。E3filter 定量的大肠杆菌蛋白质组图谱与 FASP 的聚类程度比 SP4-GB 的聚类程度更高。

然后制备分析HEK293细胞蛋白质组，并将其与最近报道的另一种过滤辅助方法（通过简便的提取和消化进行过滤辅助样品制备，FA-SPEED）进行了对比。实验数据表明，从20 μg蛋白质输入中，E3tips可以分别识别超过5,200和39,000个非冗余蛋白质组和肽段，以及近86,000个肽段特征。这些数字在重复实验中具有很高的可重复性，该方法的定量可重复性也很好。两种方法之间的定量相关性始终较高，蛋白质平均为 0.97，多肽平均为 0.93。这些数据表明两种膜类型之间具有很高的相似性。

接着制备分析小鼠肾脏组织样本的蛋白质组，组织样本往往具有较宽的动态范围和较高的复杂性。将E3tips与STrap tip（S-tip）方法进行了比较。数据表明，在三次重复实验中，E3tip 在蛋白质和肽鉴定方面超过了 S-tip。此外，近 90% 和 80% 的命中结果通过这两种方法相互识别。E3tip 内部或两种方法之间的定量相关性也很高。这些数据表明 E3tip 具有很高的可重复性，并且与 S-Tip 方法具有很大的相似性。

再接着，作者将 GB 膜铸入深孔 96 孔滤板中并处理人类唾液样本，以探究其在临床蛋白质组学分析中的潜力。平均而言，可以从五个孔中分别鉴定出 1,400 种蛋白质，几乎是之前研究报告的蛋白质数量的两倍。在五个孔中至少有三个检测到了超过 85% 的唾液蛋白，表明孔之间的差异很小。E3 plate 的成功实施为其自动化提供了明确的证据，而现有 SP4 等基于离心的方法无法实现自动化。研究表明E3可处理了体积多达1mL 的唾液样本，结果对唾液蛋白质组分析的覆盖率相当好。

对于微量样本，作者组装了E3 tip 作为代表性方法，因为它的接触面和处理量相对较小。数据显示，从 1 μg 输入的整个 HEK293 细胞裂解物来看，E3tip 的表现优于 S-tip，能够鉴定超过 3,700 种独特蛋白质和 20,000 种肽，与使用相同量裂解物输入的 SP3 和 in-StageTip (iST) 方法的鉴定输出相似。

再接着， 作者探究了E3technology 单管完成完整的样品制备的可能性。利用 Empore 技术创建了多功能 GB|C18 膜—— C18 增强型E4 技术进行低细胞分析。在这个实验中，细胞用甲醇固定在 E4 过滤器上，然后直接进行过滤器内细胞 (OFIC) 消化。之后，所得肽通过具有 C18 功能的 E4 过滤器方便地脱盐，从而在冻干后得到可用于 LCMS 的样品。由于不涉及细胞裂解，并且所有处理步骤都在同一设备中进行，因此这种 OFIC 方法应最大限度地减少样品损失。从大约 25,000 个 Jurkat 细胞开始，平均能够识别超过 4,300 种蛋白质和近 30,000 种肽。相比之下，当同样数量的细胞首先用 SDS 缓冲液裂解，然后使用上面建立的 E3 程序进行消化时，鉴定出的蛋白质减少了 20%，肽含量减少了 50%。这些数据表明传统的“细胞裂解-蛋白质消化”方法会导致大量样品损失，这对低负荷蛋白质组学分析是不利的。

回答关键的生物学问题

UD分子生物学家Mona Batish研究RNA的生物学，RNA是由我们体内的DNA制造的单链核糖核酸分子。Batish使用Yu的方法鉴定了RNA结合蛋白(RBP)， RBP与我们细胞中发现的一种称为环状RNA的非编码RNA相互作用。环状RNA可以在体内存在很长一段时间，它们可以调节基因表达，作为肿瘤抑制因子，并引起对化疗等药物的耐药性或易感性。

Batish说，rbp是许多细胞过程的关键，最终有助于确定RNA分子在细胞中的定位和功能。她想更好地了解环状RNA如何与rbp结合，这对于充分了解环状RNA作为生物标志物或疾病治疗靶点的潜在用途至关重要。

Batish说:“寻找RNA 结合蛋白是很繁琐的，尤其是当它们的丰度很低的时候，但是Yu的技术帮助我们克服了这个问题，给了我们很好的目标数据。”“它也非常可复制，这是我们谈论任何新的生物学发现时最大的因素。与我们过去所做的相比，我们发现这种新技术在样品中的一致性非常好。”

对数量有限的环境样品有效

特拉华大学地质学家Clara Chan和她实验室的副科学家Jessica Keffer研究产生铁锈的氧化铁细菌，这种细菌是具有许多重要环境功能的矿物质。这些铁氧化细菌存在于土壤、湿地、水处理系统、海滩沉积物，甚至是海底。研究人员想要了解这些铁氧化细菌使用什么蛋白质来形成铁锈矿物质，但这些生物很难培养和分析。

Chan实验室进行的一项早期蛋白质组学研究检测到的蛋白质很少，因此数据有限。Keffer之前用一种去垢剂将它们裂解，释放出里面的蛋白质和其他物质，如果细胞没有正常破裂，或者如果去垢剂对它们试图恢复的蛋白质影响不佳，这种方法可能会导致样品损失。使用离心机通过高速旋转来收集细胞也不是一种选择。这是一个常见的问题。无论研究人员使用的是生物样本还是环境样本，最大限度地减少难以获得的样本的损失都是一个关键挑战。“蛋白质很容易吸附或粘在塑料上。因此，更多的移液和转移液体意味着更多的样品损失。”“理想情况下，你希望在单个设备中以小体积处理如此珍贵的样品。”

为了解决Keffer的这个问题，Yu建议跳过细胞裂解步骤，而是使用他的团队技术平台的增强版本直接在细胞内进行反应和处理。使用E4，Keffer能够从比她以前使用过的更小的样品体积中恢复大量的肽和蛋白质。这是一个很有前途的进展，因为这意味着在未来的研究中，她不需要为了获得高质量的数据而培养大量的细胞。

“在我目前使用的数据集中，我们从我们的生物体中检测到大约78%的预测蛋白质。这比我们在之前的任何尝试中看到的蛋白质都要多，”Keffer说。“数据质量也非常高。当我们重复这些研究时，数据非常相似，这很重要，这样我们就可以对我们所看到的充满信心。”

这种类型的信息有可能告诉研究人员其他生物是否有这种产生铁锈的能力，或者导致利用这些蛋白质来创造所需的环境变化或制造新材料的技术。Chan称这个新技术平台很有前景:“能够检测到蛋白质和蛋白质的实际含量，有助于我们得出它们在做什么的结论。”“如果我们能在生长不太好的文化中做到这一点，也许我们可以进入环境，比目前的环境蛋白质组学能告诉我们的更全面地了解正在发生的事情。”

作者视角

“这确实是一种易于使用的技术。”“你不需要博士学位才能有足够的信心做蛋白质组学。我们已经使这种方法非常强大和可靠，所以每个实验室科学家都可以做高质量的蛋白质制备。”用于制备这类生物样品的产品通常都很昂贵。其中一个目标是使其比目前市场上可用的更便宜，使蛋白质组学实验的价格更接近基因组学实验的成本，从而对精准医疗和卫生保健成本产生重大影响。“如果我们现在可以降低必要的化学试剂和耗材的成本，那么如果这些测试可以用质谱法完成，那么未来所有患者都可以受益。”总体数据表明，UD开发的方法和由此产生的技术平台相当或优于现有方法。

“我们很高兴有机会将特拉华大学的这项革命性技术商业化，用于蛋白质组学消化和相关步骤，以解决蛋白质组学样品制备的瓶颈，”CDS分析部门经理说。“结合CDS Analytical Empore line的StageTips技术和MiniLab 5000液体处理机，我们的目标是建立从细胞到LC-MS的蛋白质组学样品制备的一站式解决方案，以帮助提高蛋白质组学分析的效率和节省成本，并使科学家能够更有效地探索和了解生物系统。我们很高兴为这项革命性的蛋白质组学技术做出贡献，旨在加速人类生物学深层机制的科学突破，以解决患者未满足的医疗需求。”

Yu在这项工作中的下一步工作包括将这项技术应用于更多的生物系统，并回答与人类健康更相关的问题，如病毒感染和癌症。在未来，Yu希望看到这些产品被蛋白质组学社区的研究人员采用和使用，并可能作为一种简单和一致的方式被临床医生用于日常诊断和筛查。