Science：施一公/周瑞团队揭示γ-分泌酶识别并切割底物的分子机制

　　

阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease, AD）是目前世界上患病最广泛的神经退行性疾病，其病理特征之一是病人脑组织中出现的淀粉样斑块沉积。这些斑块被认为是由β-淀粉样蛋白（amyloid-β peptides，Aβ）逐渐聚集形成的，而Aβ则来源于对淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）的切割，其中γ-分泌酶（γ-secretase）在切割APP产生不同长度的Aβ过程中发挥着关键作用。

  γ-分泌酶是由Presenilin（PS）、PEN-2、APH-1和Nicastrin（NCT）四个亚基共同组成的膜内蛋白酶复合物。遗传学证据表明，可遗传的家族性AD所携带的基因突变主要位于APP以及PS1/PS2基因上。APP首先被β-分泌酶切割为99个残基的肽段（APP-C99）,APP-C99可以被γ-分泌酶通过内肽酶活性切割为49个残基的Aβ49或48个残基的Aβ48,随后γ-分泌酶发挥羧肽酶活性，继续将Aβ49切割产生Aβ46、Aβ43和Aβ40；对Aβ48的切割产生Aβ45、Aβ42和Aβ38 (1)。

  Aβ聚集被认为与AD的发生密切相关，因此清除淀粉样蛋白是治疗AD的潜在策略。2023年7月，美国食品药品监督管理局（FDA）批准针对Aβ聚合体的单克隆抗体Lecanemab（仑卡奈单抗）用于AD治疗。然而，这些不同长度的Aβ是如何被γ-分泌酶依次剪切的，领域内提出了多种模型来猜想这一分步切割的动态过程，遗憾的是，到目前为止，这一问题仍然悬而未决，极大地限制了对AD病理的理解以及针对Aβ和γ-分泌酶的药物研发设计。

  2024年6月7日，生命科学联合中心/清华大学生命学院/西湖大学/北京生物结构前沿研究中心施一公教授团队在《科学》（Science）发表最新研究成果：《人源γ-分泌酶识别和剪切底物的分子机制》（Molecular Mechanism of Substrate Recognition and Cleavage by Human γ-Secretase）。论文报道了γ-分泌酶结合切割过程中四种中间态底物APP-C99、Aβ49、Aβ46和Aβ43的冷冻电镜结构，揭示了γ-分泌酶识别底物的分子机理，并通过这些结构的深入比较，提出“活塞模型（piston model）”来解释γ-分泌酶动态切割底物的过程。这项研究解决了AD领域困扰多年的关于γ-分泌酶切割机制的难题，对于理解Aβ产生过程以及发展新的治疗策略具有广泛的意义。

  由于酶与底物的结合-酶切-解离的过程极其动态，获得酶与底物的复合物结构难度非常大，作者引入了两个策略：1.经过大量筛选，分别在底物近膜区和酶NCT亚基上引入半胱氨酸突变,通过二硫键交联稳定复合物；2.将酶催化残基之一385位天冬氨酸（Asp385）突变为天冬酰胺（Asn），既防止底物的切割，又可以模拟催化水解的中间状态。利用该方法，作者首先获得了γ-分泌酶-APP-C99的原子分辨率结构：APP-C99包含α-螺旋区、β-strand区以及介于两者之间的铰链区，底物β-strand与PS1形成稳定的β-sheet结构，而酶切位点恰好在β-strand之前，继而切割产生Aβ49作为产物以进行后续剪切。

  利用相似的策略，结合一系列提高交联效率的方法，作者成功获取了γ-分泌酶-Aβ49的结构：Aβ49同样包含α-螺旋区、β-strand区以及介于两者之间的铰链区，不同的是Aβ49的β-strand仅由三个氨基酸残基组成，而切割位点也位于β-strand之前，这样可以成功释放三肽并产生Aβ46。三个氨基酸组成的短的β-strand解释了γ-分泌酶以每次剪切三个氨基酸为主的羧肽酶活性。随后，作者利用体外重构的方法又解析了γ-分泌酶分别结合Aβ46和Aβ43的冷冻电镜结构，Aβ46/Aβ43与Aβ49的结构特征非常相似。

  虽然之前该研究组已经报道了γ-分泌酶分别结合Notch和APP-C83的结构 (2, 3)，但是该研究的创新性在于，作者通过多种中间态底物结构的比较分析，总结了γ-分泌酶识别和切割底物的动态过程。从局部结构特征和催化机制的角度来看，γ-分泌酶的内肽酶和羧肽酶活性之间几乎没有差异，主要区别在于底物形成β-strand的长度：对于Aβ49的产生，C99形成比较长的β-strand区域；对于羧肽酶切割（Aβ49→Aβ46→Aβ43→Aβ40），底物β-strand区仅包含三个连续的氨基酸残基。随着底物向细胞内侧移位进行切割，底物跨膜α-螺旋区保持其整体长度，每次切割后，底物α-螺旋区向前拧动和转位一个螺旋（大约3个氨基酸），并形成一个新的β-strand，这种机制被总结为“活塞模型”。

  活塞模型包括两个基本原则：1.底物β-strand引导下一个切割位点。因为至少需要三个残基才能形成β-strand，所以解释了为什么Aβ49或Aβ48的切割大多是以三个残基的步骤进行的。2.每个底物在γ-分泌酶切割过程中展示了相同的结构特征，包括一个被PS1识别的跨膜α-螺旋区，引导底物切割的β-strand区，以及介于之间的连接序列。这一模型可以解释很多之前文献中报道的生化数据，包括家族性AD基因突变的影响，以及γ-分泌酶对其他100多种底物的切割模式等，为γ-分泌酶的机制研究以及针对γ-分泌酶的药物设计和优化提供重要依据。

  生命中心PI施一公实验室一直以来都将揭示AD发病机理作为重点研究方向，其中γ-分泌酶的三维结构及其作用机理的解析是一项重要的分支。2014-2015年，该组先后在Nature报道了分辨率为4.5 Å及3.4 Å人源γ-分泌酶的三维结构 (4, 5)。2018-2019年，分别在Nature和Science发表论文报道了γ-分泌酶结合重要底物Notch和APP-C83的三维结构 (2, 3)。2021年，在Cell杂志报道了γ-分泌酶结合小分子抑制剂和调节剂的原子分辨率结构，阐明了γ-分泌酶识别小分子药物的分子机理 (6)。此次发表在Science的研究是在之前研究基础上γ-分泌酶领域的又一次进步与突破。

  生命科学联合中心/清华大学生命学院/西湖大学/北京生物结构前沿研究中心施一公教授和清华大学生命学院副研究员周瑞博士是该研究论文的通讯作者。清华大学生命学院博士后郭雪飞是该论文的第一作者。清华大学生命学院博士生李浩田参与了本项工作。清华大学生命学院副教授闫创业博士和冷冻电镜平台主管雷建林博士分别对模型搭建和数据收集提供了指导。清华大学冷冻电镜平台和清华大学高性能计算平台分别为该研究的数据收集和数据处理提供了支持，冷冻电镜平台的李晓敏博士、周昵昀博士对数据收集提供了帮助。该研究得到了北京生物结构前沿研究中心（清华）、西湖大学、科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金和浙江省重点研发计划的资助。

参考文献

1. M. Takami et al., γ-Secretase: Successive Tripeptide and Tetrapeptide Release from the Transmembrane Domain of β-Carboxyl Terminal Fragment. The Journal of Neuroscience 29, 13042-13052 (2009).

2. G. Yang et al., Structural basis of Notch recognition by human γ-secretase. Nature 565, 192-197 (2018).

3. R. Zhou et al., Recognition of the amyloid precursor protein by human γ-secretase. Science 363,  (2019).

4. P. Lu et al., Three-dimensional structure of human gamma-secretase. Nature 512, 166-170 (2014).

5. X. C. Bai et al., An atomic structure of human gamma-secretase. Nature 525, 212-217 (2015).

6. G. Yang et al., Structural basis of gamma-secretase inhibition and modulation by small molecule drugs. Cell 184, 521-533 e514 (2021).

 

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adn5820