Nature Genetics：新方法大大扩展单分子测序的应用

　　

近年来，以单分子分辨率研究个体DNA的技术极大地扩展了我们对人类基因组、微生物组和疾病遗传基础的了解。有了如此详细的DNA视图，我们能够观察到以往无法检测的基因变异和结构细节。

然而，如今单分子分析的标准方法至少需要1-5 μg起始DNA。这意味着研究人员无法在样本量有限的情况下使用这些工具，比如液体活检（只有数千个细胞），这限制了这些技术的科研和临床潜力。

近日，格拉斯通研究所（Gladstone Institutes）的研究人员开发出两种新的单分子分析工具，可将所需样本量减少90%到95%。这项研究成果发表在《Nature Genetics》杂志上，展示了这些工具如何帮助科学家们解决以前无法回答的生物学问题。

对DNA进行片段化+标记

第一种新工具被称为SMRT-Tag（基于转座酶片段化的单分子实时测序）。它能够确定长片段DNA中的碱基序列，并绘制甲基基团的位置。甲基基团在基因表达中起着关键作用，对了解疾病至关重要，因此研究人员想了解它们在DNA上的配置。

共同通讯作者、格拉斯通研究所的助理研究员Vijay Ramani博士表示：“当我们只有很少的DNA时，我们不能复制更多的拷贝，并使用我们以往的实验方案。复制DNA会导致甲基化模式丢失，并引入其他错误。”

相反，他的团队采用了一种名为“转座酶片段化（tagmentation）”的方法，这种方法利用细菌Tn5转座酶，将DNA分子切割成更容易处理的片段，同时对进一步分析所需的化学成分进行标记。

研究人员面临的挑战是，如何利用转座酶片段化的化学试剂将少量的DNA打断成3 kb-5 kb的长片段。他们的方法使用发夹状结构“标记”每个片段的末端，形成DNA长环，以便测序仪可靠读取。

“我们实验室的师生们付出了巨大的努力，” Ramani谈道。“我们必须测试不同版本的Tn5以及近100种不同的条件，包括缓冲液、酶和温度。当你处理少量的DNA时，任何导致DNA丢失的操作都会让事情变得更加棘手。”

获得可行动的数据

对SMRT-Tag进行优化后，研究团队证明了它的表现与现有的方案一样出色，但DNA使用量要少得多——大约只需要40 ng DNA，相当于7 x 10⁴个细胞。

“使用PacBio的单分子测序仪，从来没有人对如此少量的DNA进行测序，并达到我们目前的覆盖度，” Ramani谈道。

接下来，研究人员将SMRT-Tag与他们之前开发的一种名为SAMOSA的方法相结合，SAMOSA代表了“单分子腺嘌呤甲基化寡核苷酸测序分析”，它能够揭示甲基化模式，这些模式反映了染色质可及性。

现在，有了这种新的SAMOSA-Tag工具，他们能够用少量的DNA来评估染色质可及性。为了证明这一点，他们将其应用于移植到小鼠体内的前列腺癌细胞上。这种方法揭示了原发瘤和转移瘤之间的染色质可及性差异，暗示了癌症转移的关键驱动因素。

共同领导这项研究的Siva Kasinathan博士称：“这只是一个例子，说明我们的工具可以应用在癌症及其他疾病的临床相关样本上，因为在这些情景下，DNA是短缺的。我们认为有一些容易获得的成果，可以解锁新的生物学知识，这对帮助今后的患者很重要。”