NGS核酸的酶法片段化，丢了西瓜（准确率）捡了芝麻？！

研究背景

NGS（下一代测序）短读测序技术的出现为癌症患者的精准医疗提供了技术支撑，也有助于对遗传疾病的理解。在NGS短读测序中，DNA片段化是制备DNA测序文库必不可少的步骤，因为测序的质量取决于DNA片段化的随机性以及所产生片段的重叠性，且由于NGS平台和测序运行中的片段大小往往不同，因此有效控制 DNA片段大小是非常有必要的。

以超声处理方法进行DNA片段化可以通过在整个基因组中均匀剪切DNA来控制DNA片段大小，因此，它是NGS测序中DNA片段化的gold standard。此外，也有采用DNA核酸内切酶的片段化方法。然而，尽管该方法被广泛使用，但酶片段化对所得序列的影响尚未得到仔细评估。因此，本研究对使用超声和酶解片段化方法制备的相同肿瘤DNA样品的体细胞变异进行了比较，分析结果显示，与通过Covaris AFA超声处理产生的文库相比，核酸内切酶处理的文库中反复出现的人为引入的SNV（单核苷酸位点变异）/indels（插入缺失）数量要多2-9倍。此外，本研究开发了一种信息学算法作为解决因核酸内切酶片段化方法而产生测序错误的解决方案。

相关研究“Sequencing artifacts derived from a library preparation method using enzymatic fragmentation”于2020年1月发表在PLOS ONE杂志上。

研究结果

一、来自不同文库制备试剂盒的体细胞SNVs/indels的不同特征

以往肿瘤样本的外显子测序显示每个样本会检测到几十到数百个SNVs/indels，然而，据经验发现，有些肿瘤样本无论其组织来源、组织学类型或组织保存方法如何，都表现出非常多的SNVs/indels，超过几千个，这些样本是使用HyperPlus试剂盒进行文库制备的，而配对的正常DNA样本是使用SureSelect试剂盒制备的，进一步对HyperPlus试剂盒制备的31个肿瘤样本(16个胃癌，13个肺癌和2个直肠癌)进行数据分析，结果发现，与使用SureSelect试剂盒（使用Covaris E220进行DNA片段化）制备的肿瘤样本数据相比，使用HyperPlus试剂盒方法（使用酶法进行DNA剪切）产生的SNV中位数(中位数：2308，范围：1,119-3,996)和indel中位数(中位数：89，范围：33-437)更高。

基于该结果差异，研究人员采用6个新鲜冷冻保存的肿瘤样本，对使用SureSelect试剂盒制备的相同肿瘤DNA文库与使用HyperPlus试剂盒制备的肿瘤DNA文库进行比较(图1)。在外显子组测序的过程中，这两个文库制备试剂盒之间的一个主要区别是：SureSelect试剂盒使用Covaris E220超声方法进行DNA片段化，而HyperPlus试剂盒是依赖于核酸内切酶处理。

图1. 使用Agilent SureSelect（Covaris机械法）和KAPA HyperPlus试剂盒（酶法）进行测序文库构建的实验流程，以及调用体细胞SNVs和indels的分析方法。

两种方法处理得到的SNVs/indels读取结果如图2所示，尽管使用相同的DNA样品量，HyperPlus（酶法）文库检测到的人为引入的SNVs/indels数量是SureSelect（covairs机械法）文库的2.3-9.9倍(图2A)。且SureSelect方法（covairs机械法）检测到的大多数SNVs/indels嵌套在HyperPlus（酶法）鉴定到的SNVs/indels中，HyperPlus（酶法）鉴定到的大多数SNVs/indels在SureSelect（covairs机械法）处理的文库中并不常见(图3)，基于以往发表的文献数据发现，HyperPlus（酶法）文库产生了大量错误的SNVs/indels，也就是说，基于内切酶进行片段化的方法进行测序产生了更多人为引入的测序错误。

对数据的进一步检查发现，许多体细胞SNV巧合地位于回文序列的中心，即“SNV中心回文序列”(SCPs)。HyperPlus（酶法）文库更频繁地生成较长的SCPs，而在SureSelect（covairs机械法）文库中没有检测到长度超过15个碱基的SCP(图2B)。

另外，基于COSMIC突变特征分析发现，HyperPlus（酶法）处理方法导致错误的测序结果，在基因组的回文序列中心有偏向性的核苷酸替换。

图2. 使用HyperPlus试剂盒（酶法）与SureSelect试剂盒（Covaris机械法）的测序结果差异比较。

图3. 在HyperPlus（酶法）和SureSelect（Covaris机械法）处理的样品中检测到的体细胞SNVs/indels的维恩图。

综合以上结果表明，从测序数据准确性角度来说，Covaris超声法剪切可以获得更高质量的文库，测序数据中人为引入的错误更少，酶法剪切人为引入的错误是Covairs的2.3-9.9倍。

二、设计一种过滤算法以去除来自HyperPlus的测序伪影

为解决由于HyperPlus方法（酶法）产生的测序噪音问题，本研究开发一种过滤算法（图4），从体细胞SNVs/indels调用结果中去除这些伪像，以优化测序数据。为评估该算法的有效性，本研究使用39份样本（9个FFPE和30个新鲜冰冻的肿瘤样本）分别通过KAPA HyperPlus（25份）、KAPA Hyper（9份）和Agilent SureSelect（5份）文库制备试剂盒进行测序，Hyper试剂盒的实验程序与HyperPlus试剂盒相似，不同之处在于Hyper试剂盒使用超声处理方式进行DNA片段化（类似于SureSelect），而不是采用核酸内切酶处理。值得注意的是，数据过滤前SureSelect（covairs机械法）处理和Hyper（covairs机械法）处理的样本在SNVs/indels的数量或突变特征模式上没有明显差异，这表明Hyper试剂盒本身并不产生HyperPlus（酶法）方式出现的测序错误，测序错误的出现是由于片段化的方式不同所引起的。

基于过滤分析算法，大大减少了HyperPlus（酶法）数据中的SNVs/indels数量，但对Hyper（covairs机械法）和SureSelect（covairs机械法）数据的影响不大，也反映出该算法可以选择性地有效去除HyperPlus（酶法）方法引入的SNVs/indels，但完全消除HyperPlus（酶法）方法产生的噪音还存在实验方面的困难。

图4. 使用HyperPlus试剂盒（酶法）制备的文库中体细胞SNVs/indels噪声的过滤算法。

总结

Covaris超声处理方法作为NGS DNA剪切的gold standard，不仅可以均匀地剪切基因组DNA，无碱基偏好性，更重要的是基于Covaris剪切获得的测序数据更加准确，数据中人为引入的错误更少，有助于获取更加高质量的测序结果。

Covaris聚焦式超声样本处理系统是在传统超声波处理基础上的技术革新，通过球面固态超声换能器将声波聚集到样本区域，对样本进行处理。聚焦声波能够以极低的能量输入获得良好的处理效果，避免传统超声能量过剩引起的样本处理过度及热损伤，为样本处理提供高效可控、重复性优良、温度恒定及无污染的处理环境。

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