MERFISH对低质量的FFPE样本说yes！

单细胞原位空间转录组技术的出现使研究人员对复杂组织的理解发生了革命性的进展，然而，发生RNA降解以及蛋白质交联的样本进行转录组研究仍然具有挑战性。尤其是福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，作为临床和分子诊断中使用最广泛的样本类型，通常无法按照最佳方案收集以保存RNA。因此，为准确定位FFPE样品中的基因表达，并绘制细胞组成的细微变化图谱，就需要一种检测效率高的空间转录组学技术。

Vizgen® MERSCOPE® 平台已经在多种高质量样本中得出出色的MERFISH数据。目前针对降解严重的低质量FFPE样本推出增强的优化MERFISH化学方法和工作流程，不论是高质量还是低质量的样本均能有效提高检测灵敏度。从此MERFISH对低质量的FFPE样本说yes！

MERSCOPE平台优化的工作流程

MERFISH使用二进制条形码对不同的mRNA种类进行编码，从而能够以单分子分辨率对几百到上千个基因进行原位分析（如图1）。

图1. MERFISH工作原理示意图

在具有完整RNA的高质量样品中，多个编码探针沿转录本的长度结合，产生足够的结合位点，使读出探针产生与指定条形码中的“1”位相对应的明亮荧光信号。而在质量较低的样品中，例如一些存档的FFPE组织，可能会发生RNA片段化，导致分散的RNA片段具有较少的编码探针可用结合位点，从而降低了每个片段的信号强度。这就使得在低RNA质量水平下，荧光信号可能会丢失到背景中，从而使信号分化，想要进行准确的转录本定量变得复杂。

为增强 RNA 降解样品中的MERFISH检测，MERSCOPE平台实施了几种优化策略（如图2）：

1. 改进RNA锚定以确保RNA片段的共定位，以更好保持转录本完整性和探针的可及性

2. 优化探针结合，最大限度地提高目标位点的占用率，从而增加读出探针的结合率

3. 增加与每个编码探针结合的读出探针的数量，显著增加荧光信号

图2. MERSCOPE平台探针优化策略

优化的工作流程提升了低质量以及高质量FFPE样本MERFISH数据的灵敏度

为了解样本质量与数据效用之间的关系，本研究对不同质量的癌症FFPE样本（图3）进行了MERFISH分析，分析结果表明，区分细胞类型和亚型的能力随着样品质量的降低而减弱，优化工作流程的使用，会明显提升MERFISH数据的灵敏度，改善样本中（子宫癌、结直肠癌、结肠癌和乳腺癌）每100μm2检测到的转录本数量，并在低质量FFPE组织中显示出更好的性能（图4），可以获得更加精细的细胞图谱和更准确的细胞间相互作用（图5）。并且，数据灵敏度的增加不会改变数据的特异性，所有测试的组织样本两种方案之间的数据相关性≥0.93（图6）。

图3. 测试的癌症样本信息

图4. 两种方案每100μm2检测到的转录本数量比较。

图5. 两种方案的转录本数量检测、细胞聚类及空间临近分析。

图6. 两种方案数据相关性的比较。

基于优化工作流程对肿瘤微环境进行免疫图谱分析

优化工作流程的灵敏度提高，使得能够更加有效地分析肿瘤微环境中的细胞类型，并更深入地研究肿瘤样本中的免疫细胞类型。如图7所示，第6、10、5、9 cluster指示免疫细胞的标志物，包括T细胞、外周T细胞、细胞毒性T细胞、辅助性T细胞和B细胞；基于该标记物，可通过UMAP和空间分析来重新聚类整个组织。

图7. FFPE子宫癌组织微环境的免疫分析图谱。

除了能够提高癌症FFPE样本的MERFISH检测性能外，优化的工作流程对新鲜冷冻组织样本的检测灵敏度也有显著提升（图8）。特别是低质量样品，优化的工作流程可以得到更大的聚类强度，对空间邻域富集的检测结果也有所改善，并且，优化的工作流程使得每100μm2可检测到的转录本数量增加超过4倍。

图8. 中低质量的人结直肠癌样本Leiden聚类分析以及两种方案每100μm2检测到的转录本数量比较。

空间转录组成像平台的灵敏度对于理解复杂组织中空间基因表达、细胞类型和细胞间相互作用至关重要。而MERSCOPE增强的工作流程，提高了新鲜冷冻组织和FFPE组织中转录本检测的灵敏度，在某些组织中的灵敏度提高了4倍以上。灵敏度的提升使得单细胞水平低质量样本以及以前难以处理的组织(如FFPE)能够进行新的转录组分析，这为癌症研究提供了巨大的机会，也对癌症进展产生新的生物学见解。

2021年，Vizgen率先将整合了MERFISH与超分辨率成像技术的MERSCOPE®️分析系统推向市场。基于核心技术MERFISH技术，MERSCOPE®️可在1天内对1cm²的组织进行超分辨成像，分辨率100nm，定位单细胞中RNA的空间分布以及定量基因表达。新型号MERSCOPE® Ultra的推出，将检测效率提升了2倍以上，成像面积增加至3cm²，而增强型工作流程的开发更进一步提升了转录本检测的灵敏度，从而实现真正意义上的原位单细胞空间转录组分析，让基因的表达和定位可视化，推动基因组学的研究步入下一代。

基因有限公司于2022年3月正式签约成为美国Vizgen公司MERSCOPE®️超分辨显微成像分析系统在中国区的合作伙伴。负责该仪器的售前技术咨询、售后安装培训、应用支持等工作。同时，上海贝晶生物技术有限公司也提供MERFISH技术服务。

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