安捷伦高通量细胞成像在细胞培养肉行业的应用-上

全球人口增长和环境压力的双重挑战，为传统畜牧业的可持续性发展造成巨大的阻力。细胞培养肉，作为合成生物学的重要应用领域之一，同时也是新兴的食品技术，以其环保、高效和人道的特点，或将成为未来食品科技发展的重要方向。

细胞培养肉（Cultivated meat），也叫做体外培养肉类，是利用动物细胞，例如肌肉卫星细胞（SC）、胚胎干细胞（ESC）、间充质干细胞（MSC）和诱导多能干细胞（iPSC）等，在实验室条件下培养生长而成的肉类产品。

与传统肉类生产相比，细胞培养肉对生态环境的潜在效益更高，表现为显著降低土地使用面积和淡水使用量，同时大量减少温室气体排放、水体富营养化和动物剥削。然而目前细胞培养肉主要面临的挑战来自以下两个方面：

培养基价格昂贵

培养基占培育肉产品总成本的 95% 以上，需要开发更优秀的无血清培养基替代传统培养基，筛选性价比更高的培养基营养组件，比如发现新的 GF 家族组件等。

种子细胞来源确认

需要建立标准化的评价用于大规模扩增的细胞的正确类型和来源。

针对以上问题，来自丹麦奥古斯大学、加拿大卡尔加里大学和加拿大多伦多大学的研究团队，通过体外高通量技术，开发了一种用于肌肉细胞增殖的简单而稳定的无血清培养基，研究结果发表在 Food Research International 。

主要研究亮点

• 采用工程学研究思路，通过 DOE（Design of Experiments，实验设计）和 RSM（Response Surface Methodology，响应面法）加速了无血清培养基开发。

• 研究表明胎球蛋白、白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒和重组 FGF2 是关键培养基成分。

• 确定了可以维持细胞增殖的优化的成分，类似于 10% 胎牛血清。

• 开发的培养基能够强有力地维持三个物种的肌肉细胞增殖。

主要开发流程

通过 Cytation 5 高通量细胞分析技术优化交互式无血清组分，使用实验设计（DOE）和响应面方法（RSM）进行优化。无血清培养基的迭代在 5 天活细胞实验中得到验证，这些实验采用无标记高对比度明场（HCBF）成像模式和长期多代培养实验。开发出来的培养基也在其他相关细胞类型中进一步测试，并通过转录组学进行研究。

图：无血清培养基开发的实验流程

无血清培养基成分的初步筛选和优化

研究团队首先使用 Cytation 5 的实时无标记成像模式观察三种原代 BSC（牛卫星细胞）的生肌特征（3day），并采用 WST-1 细胞增殖测定结果进行培养基组分初筛，进一步测试不同的细胞培养添加剂，确定补充剂的生物活性浓度范围和最佳 Growth Factor 表现。随后采用灵敏度更高的 Hoechst 染色计数法进行 DOE 筛选来评价 11 种不同成分的主要影响和相互作用，结果表明仅用胎球蛋白、BSA 和 FGF2 三种主要成分即可实现最高的相对增殖效果。

图：采用灵敏度更高的 Hoechst 染色计数法进行 DOE 筛选，评价 11 种不同培养基成分的影响和相互作用

无血清培养基迭代优化

研究团队后续通过 5 天无标记活体测定、转录组学、多种细胞类型、细胞附着测定和多传代长期实验对该培养基的方案进行验证以及稳定性测试，包括基础培养基和基础添加剂的优化、基础培养基中 Tri-basal 的条件优化、FGF2 类型优化等工作，最终确认优化的 Tri-basal 2.0+ 培养基增强了无血清细胞附着和长期增殖，为在培育肉生产中使用胎牛血清提供了替代解决方案。

图：通过 96 孔整孔 Hoechst 的细胞核计数测定进优化筛选方案，以提高准确性和稳健性

图：5 天无标记活细胞成像细胞增殖定量分析（HCBF）用于评价含有 10% 胎牛血清（FBS）和 Tri-basal 2.0+ITS 样本的基底细胞（BSC）增殖情况

图：通过细胞核计数及 5 天活细胞增殖（HCBF）实验结果表明，Tri-basal 2.0+ Ento 在 5 天的时间内表现出出色的持续增殖能力，通过去除抗生素再次得到改善，并且优于含有 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基。

图：Cytation 5 对免疫荧光染色后的细胞进行成像，Gen 5 定量测定 MHC 阳性肌管(面积)、融合指数和总核数，用于评价培养基成分对细胞生肌能力的影响。

应用方案小结

• 本研究中，精确高效的高通量增殖测定技术至关重要

• 由于 WST-1 测定缺乏灵敏度，且容易受到试剂本身的影响导致结果的偏差

• 使用 Cytation 5 系统和 Gen 5 软件进行基于图像的细胞定量计数改变了传统的使用 WST-1（代谢测定）检测方法的缺陷。

• 使用 Cytation 5 进行基于 Hoechst 的自动化细胞核计数更加准确、便宜且快速，不仅能够纠正细胞接种数量变化引入的误差，还能够统一分析标准，提高分析精确度。

仪器方案推荐

Cytation 5 & Gen 5 用于开发无血清培养基的优势：精确、高效、自动化

主要应用：

• WST-1 细胞增殖检测

• Hoechst 96 孔板整孔细胞核计数

• 高通量无标记活细胞增殖分析

• 多次传代活细胞增殖检测

• 细胞免疫荧光成像分析成肌能力

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关于安捷伦细胞分析安捷伦细胞分析平台包括xCELLigence RTCA实时细胞分析仪、Novocyte系列流式细胞仪、Seahorse能量代谢分析仪以及Synergy系列微孔板检测仪和Cytation 系列（共聚焦）细胞成像多功能微孔板检测仪。安捷伦细胞分析平台聚焦基础科研与细胞与基因治疗产品的开发全流程，作为适配新一代疗法的强大分析工具，提供多方位的细胞效力检测和深度的细胞分析，并致力于研发、生产质控以及临床的全方位检测与分析方案开发。