细胞周期分析，现在有哪些新工具？

染色体分离、细胞分裂以及细胞增殖的其他过程是癌症、衰老等多个研究领域的核心。细胞周期是高度协调并严格受控的，在单细胞水平具有适应性和异质性(1)。因此，计算工具将有助于此类研究，比如细胞周期的转录组动态研究(2)。

Bio-Rad公司流式细胞术应用科学家Sharon Sanderson解释说：“细胞周期分析领域正通过技术和方案的不断创新而向前发展。单细胞测序和高通量成像技术正帮助我们认识细胞周期及其与生物过程和疾病的相关性，但长期的细胞增殖研究需要无毒性方法。”

细胞周期分析的热度也许可以从其全球市场规模中略窥一斑。根据市场研究机构Market Research Future的预测，到2030年，全球细胞周期分析的市场规模将达到163亿美元，复合年均增长率达到9.80% (3)。

那么，细胞周期分析将如何推进您的研究项目？在此，我们将介绍一些有代表性的解决方案，以及分析工具和方法开发方面的最新进展。

流式细胞术

流式细胞术仍然是细胞周期分析时的主要工具。Cytek Biosciences公司流式细胞术分析和应用总监Kamala Tyagarajan表示：“Cytek Northern Lights全光谱流式细胞仪功能强大，不仅能够开展高参数的多重分析，还能轻松运行传统的低参数分析。”

“全光谱流式细胞仪采集每个荧光基团的整个光谱，而不像传统仪器那样检测分散的波长。这为荧光染料和试剂的组合使用带来了灵活性，即使发射峰重叠也没问题。Cytek Northern Lights系统在检测感兴趣的群体方面具有高的灵敏度和分辨率，这对细胞周期分析非常重要，”Tyagarajan补充说。

传统的细胞周期染料与流式细胞术兼容，但存在很大的限制，例如与活细胞分析不兼容。细胞增殖的指示物或标志物已成为替代的分子成像靶点，与细胞周期状态相对应。据Sanderson介绍，alamarBlue能够快速经济地定量各个细胞系中的细胞增殖和毒性，用于时间进程研究，而且比四唑盐（MTT）染料更安全。

“alamarBlue不会干扰细胞呼吸和功能，其专有的缓冲液使其高度稳定。在指示剂存在的情况下，细胞仍然能保持完整的功能和活力，可用于药物敏感性和代谢研究等一系列应用，而且可轻松放大到高通量分析，” Sanderson谈道。

Sanderson指出，alamarBlue的活性成分是刃天青（resazurin），这是一种具有细胞渗透性的无毒化合物，呈蓝色且几乎没有荧光。在进入活细胞后，刃天青被还原，呈现红色并发出强烈荧光。因此，通过这种试剂可检测呼吸过程中的氧化水平，定量测定细胞活力和细胞毒性，直接反映了细胞健康状况。

Absolute Biotech公司的首席科学官Frans Ramaekers强调，流式分析不再局限于细胞表面分子。他提到了该公司的FIX&PERM细胞固定和透化缓冲液。

“通过使用FIX&PERM，细胞内抗原的流式细胞分析也变得像表面抗原研究一样简单。FIX&PERM方案适用于研究外周血细胞样本、骨髓抽吸物、单核细胞悬液以及用实体组织和培养细胞制备的细胞悬液，”他谈道。

“一方面通过FIX&PERM来分析Ki-67和Bcl-2，另一方面利用广泛的骨髓细胞分化标志物，研究人员能够分析正常骨髓和骨髓瘤患者抽吸物中不同亚型的成熟造血细胞的增殖和抗凋亡活性，” Ramaekers继续说。“这有助于人们更好地了解骨髓恶性肿瘤的潜在致病机制。”

成像流式细胞术

许多研究人员已将流式细胞术与微流控技术等其他模式相结合，以提高其在临床实践和基础研究中的实用性。例如，成像流式细胞术克服了流式细胞术缺乏单细胞分辨率和光学显微镜通量较低的局限性(4)。

在一篇预印本文章中，Howell等人利用Cytek公司的ImageStream®X Mk II成像流式细胞仪来评估墨西哥利什曼原虫（Leishmania mexicana）的DNA复制、细胞形状和有丝分裂状态(5)。

对于成像流式细胞术而言，如何优化数据分析的自动化是一项长期的挑战。因此，Pozzi等人回顾了成像流式细胞术的数据分析挑战，这些挑战有望通过人工智能来解决(6)。

第一，图像处理应当在微秒尺度上准确进行，以便根据衰老状态等进行细胞分类。第二，辅助数据自动化将减少开发训练数据集（如细胞周期的形态指标）所需的时间。第三，有必要进行实验方案标准化，以促进各个实验室之间的数据解读。

质谱流式细胞术

质谱流式细胞术（mass cytometry）是质谱分析的一种变形，在细胞周期研究中越来越受欢迎。它不是像流式细胞术和显微镜分析那样采用荧光（光学）检测，而是采用同位素作为金属标签，在细胞雾化后进行定量。组织切片也可以雾化，从而提供生物标志物分布的拟图像。

利用质谱流式细胞术，研究人员可以获得细胞周期状态及其他代谢特征的相关指标(7)。目前，这种方法可以同时分析多达50种生物标志物，而且不会出现光谱重叠或背景干扰(8)。

Abdul-Aziz等人评估了质谱流式细胞术在评估细胞衰老方面的作用(9)。他们在单细胞水平上定量了p16表达（癌症研究的常见靶点）以及与细胞周期相对应的其他标志物。在WI-38细胞中，经过10天的氧化应激，S期的细胞数量减少，而G0期的细胞数量增加。由于单细胞质谱流式分析可以在数天内完成，研究人员认为，这种方法可能有助于血液肿瘤治疗、干细胞移植及其他医学治疗的监测。

在癌症和衰老等研究领域，细胞周期分析将继续成为热点。相关的数据分析可能带来挑战，尤其是高通量应用中或样本存在大量异质性时。不过，目前的许多工具和方案（包括自动化技术）可以简化这项任务。

参考文献

1. Stallaert W, et al. (2022). The structure of the human cell cycle. Cell Syst. 13(3):230–240.

2. Chervov A and Zinovyev A (2022). Computational challenges of cell cycle analysis using single cell transcriptomics. arXiv preprint 2208.05229 (accessed Jan 8, 2024).

3. Market Research Future (2024). Cell cycle analysis market research report information by product (consumables, instruments, & others), application (cell identification and others), end-user (academics & research institutions, hospitals & diagnostic laboratories, & others) – Global forecast till 2030. Rep. MRFR/LS/0202-HCR, New York.

4. Rees P, et al. (2022). Imaging flow cytometry. Nat. Rev. Methods Primers 2:86.

5. Howell J, et al. (2023). The use of imaging flow cytometry for rapid, high-throughput and automated analysis of the Leishmania mexicana promastigote cell cycle provides new insights into cell cycle events of short duration. bioRxiv preprint 2023.07.24.550259 (accessed Jan 8, 2024).

6. Pozzi P, et al. (2023). Artificial intelligence in imaging flow cytometry. Front. Bioinform. 3:1229052.

7. Zhao Y, et al. (2022). Physical cytometry: Detecting mass-related properties of single cells. ACS Sens. 7(1):21–36.

8. Arnett LP, et al. (2023). Reagents for mass cytometry. Chem. Rev. 123(3):1166–1205.

9. Abdul-Aziz A, et al. (2023). Mass cytometry as a tool for investigating senescence in multiple model systems. Cells 12(16):2045.