清华大、北大Nature合作发文：发现CRISPR免疫增效子（pro-CRISPR），首次建立Cas9核酸酶生长进化模型

　　

CRISPR系统是一种存在于原核生物中的适应性免疫系统，用于抵御外来DNA的入侵。在长期的免疫防御斗争中，CRISPR系统已经演化成多种类型，其中，Cas9通过引导RNA（gRNA）切割外源DNA的特性被广泛研究和应用到基因编辑领域。Cas9系统具有多种亚型，如II-A、II-B和II-C，其中II-C型的Cas9的多样性最高。然而CRISPR-Cas9系统是否存在额外的机制以对抗病毒的免疫逃逸竞争尚且未知，通过挖掘并解析这些未知的机制，有助于进一步拓展我们对于CRISPR系统进化过程的了解并且也可能进一步提升其基因编辑效率。

2024年5月29日，清华大学生命学院刘俊杰(Jun-Jie Gogo Liu)课题组联合北京大学生命学院白洋课题组和清华大学生命学院陈春来课题组在《自然》（Nature）杂志在线发表了题为“CRISPR免疫增效子PcrIIC1增强细菌Cas9系统免疫能力”（Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity）的研究论文。

通过生物信息学分析，研究团队观察到一类新型关联基因（Novel-associated genes, NAGs），显著富集存在于较大蛋白体积的II-C型Cas9的基因簇中，并推测这些NAGs可能参与到Cas9介导的细菌免疫过程中。为了进一步探索Cas9和NAGs的关系，研究人员开发了一套结构生长轨迹分析方法（structural growth trajectory analysis, SGT analysis），通过预测1381个II-C型Cas9的蛋白结构，实现了对Cas9蛋白结构演变的量化和轨迹分析。通过分析，发现了较大蛋白体积的II-C型Cas9存在自身新功能结构域生长进化的趋势，呈现出三条不同的蛋白体积逐渐变大的进化轨迹。并且研究人员还发现与NAGs的协同作用富集在三条生长轨迹的终点，这可能说明在漫长的进化过程中，Cas9系统新功能结构域的插入和NAGs的出现具有一定的相关性。

图1. 结构生长轨迹分析方法（左）和II-C型Cas9的生长轨迹图（右）

随后研究团队通过生化实验和冷冻电镜解析复合体结构表明，来自金黄色细菌属（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生长出了一个全新的增强Cas9活性的β-REC2结构域，以及一个全新的能够与其关联基因PcrIIC1互作的CTH结构域。通过蛋白间相互作用，2个CbCas9蛋白和2个PcrIIC1蛋白能够形成异源四聚体复合物。

图2. CbCas9基因簇构成（上）、CbCas9效应蛋白结构（左下）和CbCas9-PcrIIC1复合体结构（右下）

研究团队发现，PcrIIC1蛋白能够作为一种CRISPR免疫增效子（Pro-CRISPR），通过与CbCas9形成异源四聚体复合体增强其活性。CbCas9-PcrIIC1复合物表现出增强的DNA结合和切割活性，更广泛的前间隔序列邻近基序（PAM）兼容性，更强的DNA双链解旋能力以及对靶向序列互补错配（mismatch）的容忍能力。

图3. PcrIIC1增强CbCas9的DNA结合（a）、切割（b）、PAM兼容性（c）、DNA解旋（d）和错配容忍（e）能力

为了进一步探究PcrIIC1增强Cas9活性的具体机制，研究人员进一步通过结构解析发现，CbCas9-PcrIIC1复合物的能力增强来源于复合物中的两个CbCas9能够结合同一条长链DNA，通过更强的电荷相互作用，使得该复合物的DNA结合能力增强。并且，复合体中的两个CbCas9通过协同作用，使得长链DNA发生扭曲和变构，更容易被解旋，从而促进了CbCas9-PcrIIC1复合物的DNA干扰（interference）能力。同时，研究团队还发现，两个CbCas9能够对称地分别靶向长链DNA的两条单链上的靶标序列，从而提高其在基因组上搜寻靶标的效率。

最终，为了检验CRISPR免疫增效子PcrIIC1对CbCas9抗噬菌体免疫能力的影响，研究人员在大肠杆菌中进行了抗噬菌体实验。实验结果表明PcrIIC1显著提升CbCas9系统对噬菌体的抵抗，且如果破坏CbCas9与PcrIIC1的相互作用，会导致增强的免疫力丧失。以上结果说明CbCas9-PcrIIC1复合体的形成对整个CRISPR-Cas系统的免疫增强至关重要。

图4. PcrIIC1显著增强了CbCas9系统的细菌免疫活性

总的来说，这项研究开发了一套基于结构的SGT进化轨迹分析，鉴定出II-C亚型Cas9的进化趋势，首次发现了一类新型的CRISPR免疫增效子可以通过二聚化Cas9效应器提升Cas9活性，这些结果不仅有助于我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，还为未来基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具的开发奠定了基础。

清华大学生命学院刘俊杰副教授、北京大学生命学院白洋研究员和清华大学生命学院陈春来副教授为该文通讯作者；清华大学生命学院博士后张寿悦、2020级博士生孙奥、中国科学院遗传与发育生物学研究所2017级直博生钱景美和清华大学生命学院2023级博士生林铄为该文共同第一作者；此外，该项研究工作得到了中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组、北京生命科学研究所董梦秋课题组的大力支持。该工作获得了国家重点研发计划、自然科学基金委、农业部、科学探索奖和清华大学与北京大学的经费、资源支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07486-x