细胞外囊泡的等离子体纳米孔无标记成像 推进癌症检测

休斯顿大学的一名研究人员报告了一种检测癌症的新方法，这种方法可以使癌症检测像验血一样简单。该方法的准确率为98.7%，具有早期发现肿瘤、提高治疗效果的潜力。

　　

影响癌症预后的一个重要因素是早期发现。通过液体活检进行的非侵入性检测，定量和表征血液中的肿瘤衍生生物标志物、脱落的肿瘤成分（例如循环肿瘤 DNA (CTDNA)、循环肿瘤细胞 (CTC) 和循环肿瘤sEVs ）有助于改善诊断测试。 但早期癌症尚未脱落足够多的 DNA 或细胞时不易检测到。活体哺乳动物细胞会主动“释放”细胞外囊泡（sEVs，也包括外泌体、微泡等），这使得它们比脱落的细胞或 DNA 更常见，尤其是在最早阶段 。外泌体是负责细胞间通讯的 30 至200 nm的sEVs，还含有反映亲本肿瘤细胞的蛋白质、脂质和核酸，是癌症诊断的宝贵生物标志物。然而，由于外泌体的尺寸为纳米级，由于散射光不足以检测到，因此大多数分析工具通常无法“看到”外泌体。迄今为止，单个 sEV 的检测、表征和分子分析仍然是一项挑战。

2020年，休斯顿大学卡伦工程学院(Cullen College of Engineering)电子与计算机工程教授Wei-Chuan Shih首次推出了PANAROMA光学成像技术，该技术使用覆盖有金纳米片的玻璃面，使用户可以监测光透射的变化，并确定直径小至25纳米的纳米颗粒的特性。PANORAMA的名字来源于等离子体纳米孔径无标签成像(Plasmonic Nano-aperture Label-free Imaging)，标志着该技术的关键特征。最近他们在Nature旗下的《Nature communications medicine》期刊上发表文章介绍的新的研究成果：结合全景成像和荧光成像，能够检测单个小细胞外囊泡的等离子体纳米孔径无标记成像技术在癌症检测的应用。

检测血液中的囊泡数量和大小，以及囊泡包裹的miR-21

该方法具有早期发现癌症和提高治疗效果的潜力。这种非常精确的方法结合了全景成像和荧光成像，准确率高达98.7%，使研究人员能够观察到纳米尺寸的细胞外囊泡(EVs)——这些由细胞主动释放到血液中的纳米级膜泡，携带细胞内的蛋白质、核酸、代谢物或者信息，可在细胞间传递不同类型的“货物”信息。Wei-Chuan Shih教授和他的团队研究了癌症患者和非癌症患者体内细胞外囊泡的数量和囊泡包裹的“货物”，得出了引人注目的结果。

“我们观察到健康人与癌症患者样本中细胞外囊泡的数量和载货的差异，并且能够根据我们对小EV的分析区分这两个人群，”Shih在《Nature Communications Medicine》上报告说。“这些发现来自于两种成像方法的结合——我们之前开发的方法PANORAMA和sEVs发出的荧光成像——用于可视化和计数sEVs，确定它们的大小并分析囊泡里包裹的货物。”

(c)总检测颗粒计数(洗前)，(d) sEV样颗粒计数(洗前)，(e) sEV计数(洗后)，(f)通过panorama -荧光成像系统获得的健康供体血浆和不同癌症血浆的sEV(洗后)中miR-21的发生率。g盲测肉瘤和胆管癌患者血浆sEV计数(洗后)和miR-21在sEV内的发生率(洗后)。比例尺:10µm。全景等离子体纳米孔径无标记成像，NSCLC非小细胞肺癌，Eso食道，H和N头颈部，sEV小细胞外囊泡。

Shih说:“使用阈值评估，除了一个样本之外来自205名患者的所有癌症样本都超过了这个阈值，对于来自106名健康个体的健康样本，除了三个样本外其他所有样本都在阈值下，癌症检测灵敏度为99.5%，特异性为97.3%。”(见图e)

为了进一步测试血浆中标准化小EV计数检测阈值的性能，研究小组分析了来自I-IV期或复发性平滑肌肉瘤/胃肠道间质瘤和早期和晚期胆管癌的两组独立样本，这些样本被匿名标记并与健康样本混合，并达到100%的准确性。

“通过进一步优化，我们的方法可能成为癌症检测筛查的有用工具，特别是为癌症和sEV生物学提供见解。”

PANORAMA 是一种无标记、无偏见的检测、测定大小和量化血浆样本中 sEV 的方法。PANORAMA 促进了基于 sEV 内源性特性的可视化和计数，无需外源性标记或修改。通过利用 PANORAMA，可捕获了 sEV 的实时图像并分析了它们的特征（例如大小），从而为了解样本中的 sEV 种群提供了宝贵的见解。此外，在动物模型和人类参与者中，PANORAMA 量化的患病人群和健康人群中不同的 sEV 水平已经清晰可见。值得注意的是，在非癌症疾病（例如炎症疾病或慢性疾病）中，sEV 数量也可能增加，这是一个值得未来研究的领域。因此，基于 PANORAMA 的方案可用作敏感的初始癌症筛查技术，随后进行其他诊断测试，使用特定生物标志物确认癌症的性质，例如miR-21以及许多其他。

荧光在本研究中发挥了至关重要的作用，它特异性地检测和量化了miR-21（一种公认的癌症生物标志物）在已识别的 sEV 中的存在。荧光成像能够选择性地标记和可视化 PANORAMA 检测到的 sEV 群体中的miR-21，从而提供有关这种特定生物标志物的存在和丰度的更多信息。值得注意的是，并非所有癌症都表达相同的遗传生物标志物。此外，不同癌症亚群血浆样本中miR-21的出现情况也存在差异。因此，仅依靠miR-21用于癌症筛查可能存在局限性，并且缺乏检测所有类型癌症的敏感性，可能仅限于少数特定类型。

总体而言，PANORAMA 与荧光成像的结合在本研究中发挥了互补作用。PANORAMA 提供了一种无标记方法用于整体 sEV 检测和表征，从而可以分析 sEV 群体和大小分布。另一方面，使用miR-21等特定标记物的荧光成像可以进行更有针对性的分析，重点关注 sEV 中的特定癌症相关生物标记物。PANORAMA 和荧光成像相结合，为 sEV 分析提供了一种全面的方法，使我们能够探索 sEV 作为筛查和诊断应用的癌症生物标记物的潜力。

研究还发现，从非常小的肿瘤中可以检测到释放到血液循环中的 sEVs。然而，sEVs 的浓度并不是无限制地与肿瘤大小成比例增加，而是迅速达到稳态水平，即使肿瘤增大到必须牺牲动物的程度，也表明存在一种消除或排泄代谢机制，可以跟上不断生长的肿瘤产生的 sEVs 的增加。研究还观察到癌症患者的稳态水平趋于稳定，就像从临床前模型中看到的那样——sEVs 的水平似乎处于比非癌症状态高约 8 倍的稳态水平，表现出不同比例的miR-21标记不同癌症类型，具有 100% 的癌症特异性。值得注意的是，这种升高的 sEV 水平在个体之间或不同来源或阶段的肿瘤之间几乎没有差异。虽然目前尚不清楚产生这种稳态的生理过程，但个体血液中较高的 sEV 稳态水平可以作为癌症存在的通用生物标志物。PANORAMA 这样能够以高灵敏度检测、量化和表征 sEV 的技术可能有助于早期癌症检测，即使在癌症发展的最早阶段也是如此。