创新单分子荧光成像FRETfluor标签 用Cy3、Cy5和DNA构建27种标签的新调色板

芝加哥大学普利兹克分子工程学院的研究人员在5月15日发表在《自然纳米技术》上的一篇论文中概述了一种单分子荧光多路复用的新技术。这项新技术使用三种简单的化学构建块来设计几十个“FRETfluor”标签，创造出更漂亮、更细微的颜色光谱，研究人员可以用来标记生物分子。

　　

研究人员通常通过化学方式附着“荧光基团”来研究蛋白质或氨基酸等生物分子，当被激发后，在高倍显微镜成像下，这些荧光基团或标签会呈现彩虹般的颜色，可以示踪、可以帮助检测疾病或识别遗传条件，为研究人员提供了丰富的信息。

一次要检测一种以上的分子——多重检测，需要使用发出不同颜色光的其他类型的荧光基团。但是在单分子水平上区分不同的颜色是非常困难的。这就是为什么大多数显微镜只能看到三到四种颜色。虽然可以使用多种方法来突破这种限制——例如重复多轮标记成像洗脱，或者使用更多激光器的复杂设置。然而，想要用一种简单而快速的方法来看到许多颜色仍然是一个主要的挑战。

芝加哥大学普利兹克分子工程学院的研究人员在今天发表在《Nature Nanotechnology》期刊上的一篇论文中概述了一种解决这一挑战的新方法。Squires实验室概述的一项新技术，仅使用三种简单的化学“模块”——Cy3，Cy5和DNA，设计出数十个“FRETfluor”标签，可以用来标记更多种生物分子。

“我们的方法更简单。这是一次标记，一次成像，”共同第一作者、芝加哥大学普利兹克分子工程博士候选人Jiachong Chu说。这意味着你可以事半功倍。目前，我们的新技术是该领域最好的。”

通往多重检测的新途径

这一研究领域的最终目标——PME团队的论文比以往任何时候都更接近的目标——是多重检测。

纽鲍尔家族分子工程助理教授 Allison Squires说:“多重检测意味着能够在同一分析中检测不止一种分子，你可能有10种、50种或数百种不同的蛋白质想要识别。”“有了这项新技术，我们可以检测几十个。我相信我们可以将其扩展到数百个。”

为了应对这一挑战，Squires实验室团队发现了一种创新的新方法，使用一种成熟的技术：荧光共振能量转移（FRET，Förster resonance energy transfer）。FRET是一种描述能量如何在光敏分子之间传递的机制——一个荧光分子（供体）在被激发后，通过偶极相互作用，将其激发态能量非辐射地转移到一个非常邻近的分子（受体），使得受体分子激发，而供体分子回到基态。研究人员可以利用这个方法报告两个分子何时靠近相互作用、衡量分子不同部分之间的距离。这一现象由德国物理学家Theodor Förster在1948年提出。

“这个项目以一种新的方式利用了FRET，”第一作者之一、化学博士候选人Ayesha Ejaz说。FRET通常用于测量距离和观察生物分子的动力学。我们改变了供体和受体染料之间的间距，以创造不同的FRET效率和其他特性，我们用这些特性来识别不同的结构。”

PME团队的研究中使用的27个标签是27个“FRETfluors”，他们使用DNA，绿色荧光基团Cy3和红色荧光基团Cy5，进行组合设计。作者首先创建了一系列“ABN”结构，将非磺化的Cy3和Cy5分别整合到“A”和“B”DNA链中，由6≤N≤20的N碱基对分隔(图1a显示AB9，ABN的N可以是6-20)。下方的“桥”链用于对核酸靶点进行序列特异性标记或添加用于常见标记化学的官能团。除了ABN，作者通过修改Cy3供体的DNA序列和连接化学键，以及添加额外的Cy3，构建了与ABN具有不同光物理性质的其他FRETfluor类型(图1b)。与ABN结构相比，AB_sk的B_sk缺少Cy3和Cy5的未配对碱基，降低了Cy3的寿命和量子效率。A_cB的A_c在5 '端携带额外的单个Cy3，增加了亮度，降低了Cy3的净寿命。AB_in的B_in在桥链的3′端和B链的5′端之间加入了一个额外的Cy3，增加了亮度，但对Cy3的净寿命仅略有影响。Cy3和Cy5荧光基团的数量变化、荧光基团之间的距离微妙变化，都影响能量传递效率而导致产生能够区分的不同光物理性质，除了发出不同颜色的光，每一种FRETfluor都表现出其他可调整的特性，这些特性使得研究人员可以在不到一秒的时间内识别出极低浓度下的FRETfluor。

FRETfluor设计使用最少的构建模块（DNA和两种荧光基团），利用染料光物理的位点特异性可调谐性作为额外的多重维度，从而组合扩展FRET的多重检测能力。

Ejaz说：“通常，当人们想要同时观察多种组分，比如一个细胞的不同部分，他们会用不同的荧光标签给每个成分贴上不同的标签，发出特定颜色的光。但可同时用的荧光标签仅限于四到五种颜色，”“如果可以使用FRETfluor，那么我们可以增加可用于荧光显微镜的'颜色'的数量。我们目前正在测试FRETfluor在不同类型的实验和环境中的工作情况，这将使我们更好地了解所有的可能性。”“这项研究的一个可能的未来方向是最终用这些FRETfluor取代普通的荧光基团标签。

灵敏和简单

新的多重检测技术的吸引力主要来自于灵敏度和简单性。“每个人都想让自己喜欢的分析能够多重化。”当时间充裕或者样本不会变化时可以采用很多别的方法。“我们要解决的，是当你没有太多时间，。。。或者你只有很少一点样本、当每个分子流过你的通道时你只有一次机会来识别它们时。我们可以在不到一秒的时间内识别出低至数十飞摩尔浓度（femtomolar）的FRETfluors。”

简单也是关键——可以使用普通的化学试剂来构建FRETfluors，可以用一种只需要单道激光就能读取的技术。“我们只标记目标一次，只做一次读数，”Chu说。“在这种情况下，我们可以同时创建和使用27个不同的标签。”

Squires描述了现有技术如何与FRETfluors一起使用，以获得更多的多重检测的好处——“你可以引入特殊的激光激发方案，或者结合其他性质略有不同的荧光基团”——这将提高现有标签的读数。Squires说，将这些多重检测工具应用到他们更强大的新技术中，可以开辟新的研究和应用领域。“成像和基于流动的生物医学分析的这些改进将使下一代创新成为可能。”