神经退行性疾病的新希望

PacBio PureTarget无扩增靶向测序使痴呆症研究的前沿进展成为可能。

　　

四年前，神经学家Claire Clelland，医学博士和她在加州大学旧金山分校威尔神经科学研究所的实验室发起了一个开创性的研究痴呆症的项目。作为一名医生兼科学家，Clelland博士不仅治疗痴呆症患者，而且还站在研究和开发旨在治疗或可能治愈这种疾病的新疗法的最前沿。她的研究重点是利用CRISPR基因编辑来靶向神经退行性疾病的遗传形式。她致力于细致地量化这些编辑的结果，建立神经系统疾病基因治疗的最佳实践，并创建用于未来临床试验的工具。

据估计，全世界有超过5500万人患有痴呆症，随着人口老龄化，这一数字预计还会上升。Clelland博士对痴呆症的调查使她和她的团队把重点放在了C9orf72基因上。C9orf72基因是额颞叶痴呆和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的主要遗传原因，ALS有时也被称为卢伽雷氏病。“我们对这个基因非常感兴趣，因为C9orf72适合CRISPR治疗，而且在ALS中进行临床试验比在痴呆症中更直接。我们的目标是开发一种CRISPR疗法，从基因组中去除突变，同时保持正常的基因功能，”Clelland博士说。“遗传学是众所周知的，生物学与基因突变有关，但困难的部分是非常大的重复扩增，这是传统测序工具无法做到的。你不能用PCR扩增大的重复序列。”

串联重复序列是人类基因组中最丰富的变异类型之一，由于其重复性，它们在基因组中具有最高的突变率。这种基因组的不稳定性是ALS等疾病的主要驱动因素。此外，传统的测序方法依赖于某种形式的扩增，一直在与包含重复序列的基因组区域作斗争。“我们甚至在弄清楚我们拥有的细胞系中重复扩增的大小时陷入了困境——试图弄清楚我们的细胞系有什么突变，以及我们是否用CRISPR纠正了它们。我们很难判断，”Clelland博士回忆道。

这就是PureTarget重复扩展面板的用途。这种无扩增的解决方案对Clelland博士的研究来说是革命性的。与基因分型和下一代测序方法相比，PureTarget重复序列扩增面板为重复序列扩增分析提供了可扩展且更全面的解决方案。有了PureTarget和前体方法No-amp, Clelland博士和她的团队可以量化细胞系中发生的事情，并且能够精确地确定不同细胞系的大小，多达数千次重复——这是他们用传统测序技术无法量化的。“我们可以量化它，然后我们可以看到基因编辑后发生的变化，为我们开辟了一条以前不可能的研究途径，”Clelland博士说。“PureTarget更加可靠和可扩展，降低了成本，因此我们可以进行更多的测试。”

Clelland说的可扩展是指在PureTarget之前，她的团队每次无扩增运行可以做大约5到10个样本。有了PureTarget，他们可以从每次运行16个样品开始，并且仍然有剩余的产能，这有助于降低他们的总体成本。

该团队目前正在测试使用该协议以公正的方式读出CRISPR编辑结果的能力。Clelland博士解释说:“因为它不是基于PCR的，所以没有放大偏倚，我们现在使用这项技术来观察细胞池而不是克隆细胞系的编辑结果。PCR扩增偏倚可能会影响结果，我们想看看扩增偏倚到底是什么。”