能否在动物体内培养人类肝细胞以进行肝移植？中科院异种嵌合培养功能性肝细胞带来启示

中科院动物所的研究人员发表在《Stem Cell Reports》期刊上的一项研究证明从异种嵌合动物肝脏中分离的功能性小鼠肝细胞可有效减轻小鼠慢性肝纤维化长。由此启发在猪等大型动物体内培养人类肝细胞可能是解决移植短缺的一种方法。

　　

由病毒感染、酗酒、肥胖或癌症引起的肝病，在全世界每25例死亡中就有1例死亡。肝脏移植可以挽救终末期肝病患者的生命。然而，该手术存在供体短缺、技术挑战和侵入性手术以及移植受者需要终身免疫抑制药物等方面的局限性。整个器官移植的另一种选择是侵入性较小的分离的人肝细胞注射，但供体短缺仍然是一个问题。利用种间胚泡互补在不同动物物种中获得足够数量的人类肝细胞或整个器官移植是克服这些障碍的一种方法。

一个重要的问题是，在不同物种中生长的肝细胞是否具有完全的功能。为了找到答案，北京中国科学院的研究人员将小鼠胚胎干细胞注射到早期的大鼠胚胎中。从这些工程胚胎中诞生的小鼠-大鼠嵌合体在包括肝脏在内的身体大部分部位都含有小鼠细胞。从嵌合肝脏中富集的活小鼠肝细胞比例高达20.6%。令人鼓舞的是，在一组基于实验室的测试中，小鼠-大鼠嵌合体中生长的小鼠肝细胞具有正常的外观和成熟的功能。此外，小鼠-大鼠嵌合体分离出来的小鼠肝细胞可以移植到肝损伤小鼠模型体内，并且在缓解慢性肝纤维化方面具有与正常小鼠肝细胞相似的治疗效果。最近发表在《Stem Cell Reports》期刊上的这一数据，为功能性肝细胞可以在不同物种中生长提供了原理证明，并可能为移植短缺提供解决方案。未来的工作需要开发在猪等大型动物体内培养人类肝细胞的有效技术，并研究这些人类肝细胞是否具有完全的功能。

主要实验步骤包括：

• 构建小鼠-大鼠嵌合体：从携带绿色荧光蛋白(GFP)的129和C57品系小鼠中建立了两种不同的小鼠胚胎干细胞(ESC)系，用于细胞追踪。将GFP小鼠胚胎干细胞注射到大鼠囊胚中，观察嵌合囊胚中的荧光标记。将嵌合囊胚移植到假孕大鼠的子宫中，至胚胎日(E)13.5时，胚胎表现出高嵌合贡献百分比。

• 嵌合胎儿分析：统计两种小鼠ESC系产生的嵌合胎儿比例，约为14%–18%。检测嵌合体的荧光信号，探索小鼠ESC对不同实质器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑）的贡献，并通过基因组Gapdh的PCR检测，确认上述六个实质器官中嵌合的证据。FACS检测检测来自各种实质器官的GFP阳性细胞，确定嵌合体肝脏中GFP阳性细胞的比例。

• 肝细胞分离：从8周大的成年种间嵌合体中分离肝细胞，使用优化的流式分选方法富集GFP阳性肝细胞。体外培养分离的肝细胞，并评估其成熟肝功能，包括脂质积累、糖原储存、尿素合成和肝脏标志物表达。使用RNA测序(RNA-seq)分析种间嵌合体衍生的肝细胞中的基因表达，与内源性肝细胞进行比较。通过聚类分析和差异分析，确定嵌合肝细胞与WT肝细胞、iHep细胞和体外分化的肝细胞的相似性。进行GO和KEGG分析，以评估与肝功能相关的基因表达和通路。

• 分离的肝细胞移植慢性肝纤维化模型：使用四氯化碳(CCl4)在免疫缺陷小鼠(NOD SCID)中模拟慢性纤维化损伤。在建立慢性肝纤维化模型后，进行肝细胞移植(HT)，观察移植后肝细胞的定植和对慢性纤维化的缓解效果。通过血清样本检查、肝脏表面观察、组织染色等方法，评估移植后肝损伤的减轻和纤维化缓解情况。

• 实验亮点：

• 通过囊胚互补技术从小鼠-大鼠嵌合体中分离出小鼠胚胎干细胞(ESC)衍生的肝细胞，并对这些肝细胞进行了功能鉴定和促进肝病恢复能力的研究。研究发现，这些种间嵌合体衍生的肝细胞具有成熟的肝功能，与内源性肝细胞相似，并且能够减轻小鼠的慢性肝纤维化。研究结果提示嵌合体来源的肝细胞有可能在未来临床应用中用于补充肝细胞移植短缺的潜力。

• 种间嵌合体衍生的肝细胞具有了成熟肝细胞的一些功能特征，这些细胞能够缓解CCl4引起的慢性肝纤维化，表明它们在临床移植应用中具有潜在的体内作用。研究还发现，种间嵌合体衍生的肝细胞有助于受体的胆管，可以促进在肝脏中产生除肝细胞外的其他类型的细胞，促进整个肝脏的重建。这些肝细胞表现出抑癌基因Trp53的高表达以及Kras和Pik3ca以及血管内皮生长因子基因的低表达，且在移植后没有观察到肿瘤，表明它们不会产生肿瘤。

• 猪肝脏移植获得成功后，在猪等大型动物中嵌合培养人类肝细胞可能也有望为肝细胞移植面临的移植短缺带来一种新的可能性。




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