Nature Methods：现在可以一次对1万个或更多的磷酸化位点进行功能测试

LJI研究人员分享了一种新的、快速的方法来研究翻译后修饰。“我们现在可以一次对1万个或更多的磷酸化位点进行功能测试。”

　　

现在想象一下，你骑着一辆自行车，车把上粘着一个巨大的沙滩球。这种“修改”可能会大大改变你的体验。

在我们的细胞中，被称为磷酸基团的分子不断地附着在蛋白质上或从蛋白质上分离。这些“翻译后修饰”改变了我们蛋白质的功能。

拉霍亚免疫学研究所(LJI)助理教授Samuel Myers博士说:“小种类的化学‘装饰品’以非常快的方式从蛋白质中添加或移除，这些修饰改变了蛋白质与其他生物分子的相互作用。”

Myers领导LJI的免疫化学电路实验室，他的团队率先使用质谱，先进的基因组工程工具和表型筛选来研究免疫细胞中重要作用的蛋白质修饰。Myers和他的同事最近开发了一种新方法，发表在《自然方法》上，可以快速评估磷酸基团附着在蛋白质上并调节其功能的“磷酸化位点”。

对于研究蛋白质如何在免疫系统中发挥作用的科学家来说，这种方法是一个重大的飞跃。“这种方法基本上创造了一个全新的实验世界，人们可以做，”Samuel Myers补充说。

在这项新研究中，研究人员使用这种方法揭示了在抗病T细胞中形成复杂“信号通路”的蛋白质。

“我们对这些信号传导途径知之甚少，这种新方法为研究人员了解更多信息打开了大门。” 

新方法是如何工作的

为了制造蛋白质，细胞将DNA“转录”成一种叫做mRNA的有用分子。然后细胞“翻译”mRNA代码来组装蛋白质。然后，蛋白质被修饰以达到最终的活性形式。在这项新研究中，迈尔斯和他的团队专注于构成触发T细胞激活的信号通路的修饰。

T细胞激活是指T细胞准备好对抗病原体。“T细胞激活是许多自身免疫性疾病的关键，而T细胞激活的问题是癌症不能被免疫系统妥善处理的原因，”Myers说。“因此，我们需要对信号传导和T细胞激活途径有更高的理解。”

T细胞在激活过程中协调大量新的翻译后修饰。Samuel Myers和他的同事们想知道磷酸基团附着在这些蛋白质上的确切位置。这些修饰如何影响功能?它们会增加还是减少蛋白质的功能——是否会对T细胞的激活产生影响?

为了找到答案，科学家们利用了一种名为cas9介导的碱基编辑器的基因编辑工具，他们利用这种工具对T细胞的DNA代码进行了非常小的、有针对性的调整。这给科学家们提供了一个突变蛋白库，这些突变蛋白不能再以同样的方式进行修饰。然后，他们促使突变的T细胞根据其改变的功能进行组装。

由于突变的DNA，最终是RNA，这些新的蛋白质缺少了它们通常的磷酸化位点。迈尔斯和他的团队随后测试了新蛋白质的功能是减少还是增加，或者这些变化是否导致了功能上的差异。

新方法让他们以闪电般的速度找到了答案。“人们通常一次观察10到20个磷酸化位点，但因为我们是一个质谱实验室，我们可以使用这种技术来观察所有的磷酸化，我们现在可以一次对10,000或更多的磷酸化位点进行功能测试。”

科学家们迅速分析了大约11000个磷酸化位点。然后，他们与LJI下一代测序核心合作，对编辑过的T细胞进行分析。他们的分析揭示了在细胞准备对抗疾病时，磷酸基团如何指导特定的基因表达反应。

Samuel Myers说:“根据我们制造的突变，我们可能实际上能够调整T细胞激活途径中不同基因亚群的水平。”

展望未来，Myers希望研究人员能够进一步进行基因“调整”，并弄清楚如何激活特定的免疫细胞来对抗疾病。例如，科学家可能希望只激活特定的T细胞亚群来阻止癌症的发展。“我们能否在治疗癌症的过程中激活CD8+‘杀手’T细胞，而不激活通常会抑制免疫系统的调节性T细胞?”

Myers补充说，磷酸基团并不是唯一改变蛋白质功能的分子。正如他解释的那样，这种新方法可以应用于研究许多类型的翻译后修饰，包括迈尔斯称之为“初恋”的修饰，O-GlcNAc。