Cell子刊：细胞环境有效地缓冲了被认为在体外导致LLPS的非特异性弱相互作用

细胞与数百万不同的生物分子嗡嗡作响，这些分子在它们的亚结构中混乱地扩散，但它们设法确保了精致的功能和空间特异性。不同的生物分子在细胞过程中特异性地相互作用，并导致靶向细胞反应。这通常是通过引导生物分子进入亚细胞区室来实现的。像线粒体这样的隔室在空间上被膜隔开。其他的，如核仁，根本没有膜边界。这些无膜的隔室是如何形成的仍然是生物学中最大的谜团之一。近年来，一种称为液-液相分离(LLPS)的现象被提出作为隔室组装的驱动力。马克斯普朗克分子生理学研究所所长Andrea Musacchio的团队现在已经开发出一种验证策略来评估LLPS在室形成中的作用，并评估检测LLPS特性的常用方法。将该策略应用于细胞分裂期间的着丝粒组装过程，该过程被认为是由LLPS支架(染色体乘客复合体，CPC)驱动的，但未能确定LLPS是一个关键的驱动因素，证实了这些检测的低预测能力。这种新策略有可能成为验证目前已确定的其他潜在LLPS驱动因素作用的重要工具。

　　

蛋白质通过与其他蛋白质的相互作用来完成我们身体的大部分功能，但它们面临着一个两难境地——它们在细胞中与4000万个潜在的相互作用伙伴一起移动。因此，寻找合适的伴侣似乎是大海捞针。尽管如此，如果一个蛋白质偶然在正确的时间遇到正确的伴侣的可能性似乎很低，细胞已经找到了一种将蛋白质聚集在一起的策略，就像在咖啡馆或俱乐部中遇到潜在的伴侣一样:空间线索引导蛋白质到确定的细胞区室，如质膜或线粒体。例如，细胞分裂的过程是由细胞膜上的信号传导过程启动的，该过程激活酶，酶的信号最终到达细胞核，触发目标基因转录。在随后的细胞分裂过程中，许多特定的蛋白质相互作用导致在染色体的着丝粒处形成多层蛋白质复合物，从而确保母细胞中的染色体无差错地分布到两个子细胞中。大自然已经为相互作用的蛋白质开发了一种特定的化学物质:相互作用的蛋白质配备了进化保守和暴露的界面，在其3d结构中具有详细的化学特性，彼此互补。这些基序存在于不同的物种中，并使高度特异性的蛋白质相互作用成为可能。

范式的转变?

在上个世纪之交，第一个不受物理边界限制的细胞区室首次被观察到。我们现在知道核仁、p体或应激颗粒集中了大分子，主要是蛋白质和RNA，并在细胞中具有重要功能。这些无膜腔室的发现开辟了一个新的研究领域，充满了悬而未决的问题，其中最具挑战性的是这些腔室是如何形成的以及它们是如何保持它们的结构的。近年来，这些隔室是通过一种叫做液-液分离或液-液相分离的过程形成的，类似于在水中自发形成的油滴，这种想法获得了相当大的动力。根据这一观点，无膜隔室是“凝聚物”，其形成是基于“驱动”蛋白的短暂、弱和非特异性相互作用，最终导致它们以高于周围介质的浓度积聚在那里。迄今为止，研究细胞外蛋白质相分离特性的实验已经确定了数十种这些驱动因素，包括染色体乘客复合物(CPC)，据称它在有丝分裂期间在着丝粒形成凝聚物，以调节其组织和功能。

体外不是体内-你不能忽视细胞质

“对于许多科学家来说，相分离已经成为无膜室形成的默认解释。然而，几乎没有证据表明，在体外进行的LLPS测定可以真正预测细胞环境中的生理过程，”Musacchio说。与他的团队一起，他制定了一种策略来评估广泛使用的LLPS分析及其预测能力，并将其应用于CPC。“在我们看来，分析的一个主要弱点是它不能以足够的准确性模拟溶剂。溶剂决定了蛋白质的溶解度，从而决定了它与其他蛋白质相互作用的能力”。为了尽可能地模拟细胞的自然环境，科学家将稀释的细菌或哺乳动物细胞裂解物添加到标准的LLPS缓冲液中。即使在高度稀释的浓度下，裂解物也完全阻止了凝析物的形成。为了评估这有多普遍，科学家们用另外几种蛋白质重复了同样的实验，这些蛋白质在标准分析中都显示出LLPS特性。事实上，在所有情况下，细胞裂解物的加入溶解了“凝聚物”。Musacchio说:“这些结果证实了我们的假设，即细胞环境有效地缓冲了被认为在体外导致LLPS的非特异性弱相互作用。”

预测能力差

细胞中蛋白质的相互作用和功能受到所谓的翻译后修饰的强烈调节。例如，在关键位置有针对性地添加或去除磷酸基团，可以立即破坏两种蛋白质之间的相互作用。这些自然修饰可以在实验室中通过突变来模拟，并且是研究许多细胞过程的首选方法。通过在四个参与磷酸化信号识别的残基上引入突变，科学家产生了一个CPC突变体，它不能被招募到着丝粒上，也不会在那里积累。尽管如此，该突变体在体外实验中仍显示出完全的LLPS潜力，表明该实验无法预测CPC的定位和功能。

“我们的研究结果表明，体外单一成分的LLPS不能预测在复杂和拥挤的细胞环境中的溶解度和定位。Musacchio说:“通过已建立的试验确定的推定LLPS支架清单将需要广泛的重新检查，我们在这里提出的验证策略可能会指导这项工作。”在未来，我们计划用许多假定的LLPS支架重复我们的实验，特别是那些已经成为LLPS领域发展的旗舰的支架。我们的实验表明，细胞质溶胶是一种强效溶剂，其作用不容忽视。因此，制备合适的细胞培养基作为评价体外生化反应的标准是非常重要的。我们将努力为这一研究领域做出贡献。”